HAS1和HAS2蛋白催化合成大分子量的HA HAS-3則催化合成較短的HA鏈 Heldin的研究早已證實人間皮細胞(HMCs)能合成大量透明質酸（HA），新合成的HA在細胞外形成一環繞細胞的胞衣結構，對細胞有保護作用。最近研究已證實哺乳動物有三種透明質酸合成酶基因HAS-1、HAS-2、HAS-3，這三個基因的產物透明質酸合成酶1(HAS-1)、HAS-2和HAS-3在氨基酸序列和分子結構特徵上有很大的同源性。雖然酶學特徵各有不同，這三種酶都可以在細胞膜內側面催化透明質酸鏈合成，但他們催化合成的HA鏈的

Presentation on theme: "HAS1和HAS2蛋白催化合成大分子量的HA HAS-3則催化合成較短的HA鏈 Heldin的研究早已證實人間皮細胞(HMCs)能合成大量透明質酸（HA），新合成的HA在細胞外形成一環繞細胞的胞衣結構，對細胞有保護作用。最近研究已證實哺乳動物有三種透明質酸合成酶基因HAS-1、HAS-2、HAS-3，這三個基因的產物透明質酸合成酶1(HAS-1)、HAS-2和HAS-3在氨基酸序列和分子結構特徵上有很大的同源性。雖然酶學特徵各有不同，這三種酶都可以在細胞膜內側面催化透明質酸鏈合成，但他們催化合成的HA鏈的"— Presentation transcript:

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9 HAS1和HAS2蛋白催化合成大分子量的HA HAS-3則催化合成較短的HA鏈
Heldin的研究早已證實人間皮細胞(HMCs)能合成大量透明質酸（HA），新合成的HA在細胞外形成一環繞細胞的胞衣結構，對細胞有保護作用。最近研究已證實哺乳動物有三種透明質酸合成酶基因HAS-1、HAS-2、HAS-3，這三個基因的產物透明質酸合成酶1(HAS-1)、HAS-2和HAS-3在氨基酸序列和分子結構特徵上有很大的同源性。雖然酶學特徵各有不同，這三種酶都可以在細胞膜內側面催化透明質酸鏈合成，但他們催化合成的HA鏈的長度卻各不相同。HAS1和HAS2蛋白催化合成大分子量的HA， HAS-3則催化合成較短的HA鏈。

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11 RT – PCR(聚合酶連鎖反應) RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄為DNA，再進行聚合酶反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為互補DNA(cDNA)，再進行聚合酶反應。 3.HAS-2是HPMCs透明質酸合成和細胞細胞衣樣結構形成的關鍵酶。正常生理狀態下，人腹膜間皮細胞以催化合成大分子量透明質酸為主。 4.炎症因數LPS、TNF-α、IL-1β均使HPMCs合成HA增加。由於其對HAS-3 mRNA表達的促進作用是主要的，故其主要促進低分子透明質酸的合成。 合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧！聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素，在1955年發現，一開始生物學家的想法很簡單，就是模仿生物體內的反應，把模板DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的Thermus Aquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。 那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄酶(reverse transcriptase)，也就是把RNA轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄為DNA，再進行聚合酶反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為互補DNA(cDNA)，再進行聚合酶反應。 至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。 現在我們了解了題目的後半段，那該來談談正規化的意義了， 一般生物學實驗常常使用管家基因(housekeeping gene)來當作對照組，這些基因廣泛存在各種生物細胞體內，科學家們假設他們的含量並不會因為各種實驗條件而有太大的變化，所以當我們要比較兩個實驗條件下某個基因表現的變化時，就需要用管家基因的表現當作基準，再來比較目標基因的變化，其實也有其他方法，例如以細胞數來當標準，但是，到目前為止細胞數的定量，也還停留在非常不準確的情況，所以用管家基因為準的假設仍是最常見的方式。 Jo的看法，就是他認為以單一管家基因為準的方式是不合理的，因為實驗結果很有可能受到管家基因表現變化的影響，他認為應該綜合至少三個(但不超過六個)管家基因的表現為評判標準，至於他所採用的方法..

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13 5.高濃度葡萄糖（90mmol/L），低濃度葡萄糖(30mmol/L),葡聚糖(5%)及90mmol/L甘露醇都促進人腹膜間皮細胞透明質酸合成。高濃度葡萄糖促進HA合成的作用最為明顯，其同時促進HAS-2和HAS-3m RNA的表達。與高濃度葡萄糖相比，葡聚糖促進HA合成的作用較弱，其對HAS-3mRNA沒有影響，主要促進大分子透明質酸的合成，因而更接近HPMCs的生理狀態。這一作用與各組間滲透壓差可能無關。

14 組織學分析

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