实验五 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 质粒DNA的连接和转化.

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1 实验五 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 质粒DNA的连接和转化

2 第一部分 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收
——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶 中DNA片段

3 实验目的： 掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术; 了解其他几种方法的原理与操作技术。

4 DNA片段分离回收常用方法： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法 玻璃奶法

5 电洗脱法 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相。 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。

6 低熔点琼脂糖凝胶法 将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。
待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的EP管中，加300 µL TE。 65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。 酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。

7 DEAE滤膜插片法 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。
电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。

8 玻璃奶法

9 实验原理： 玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时溶解分离。

10 DNA 结合率影响因素： 盐浓度： pH值： DNA<100bp:高盐状态下结合率高。 DNA>100bp:低盐状态下结合率高。

11 应 用： 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；
应 用： 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； DNA浓缩，去盐及去除杂质。

12 本方法的优点： 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；
简便：所需主要仪器是一架台式离心机； 快速：整个回收过程只需半个小时； 高效：回收效率达到70%以上； 多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等； 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

13 实验材料： 使用Omega bio-Tek胶回收试剂盒（Ultra-Sep Gel Extraction Kit） 超纯水 无水乙醇
Ultra-Sep Binding Buffer ml Ultra-Sep Beads ml DNA Wash Buffer ×80ml Elution Buffer ml 超纯水 无水乙醇

14 方法和步骤： 琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段 切取所要的DNA条带 溶解琼脂糖/EB凝胶 结合玻璃奶 离心沉淀玻璃奶 洗脱DNA

15 方法和步骤： 1．琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。 2．紫外灯下切取所要的DNA条带。
3．将切下胶块放入1.5ml EP管中，称重，以确定胶条的体积。 设定胶的密度为1g/ml，例如0.2g胶认为其体积为0.2ml。 4.加入等体积的Ultra-Sep Binding Buffer。 对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝胶，加入3×体积的Binding Buffer。

16 5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 µl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮Ultra-Sep Beads。 注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色，则加入5 µl 5M NaAC（pH5.2）以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。

17 6．10,000×g室温离心1min，使Ultra-Sep Beads沉淀，弃上清。
7．加入300 µl Ultra-Sep Binding Buffer，涡旋震荡Ultra-Sep Beads以洗涤玻璃奶。10,000×g室温离心1min，弃上清。 8．加入750 µl预先按瓶上标签说明用无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer。涡旋震荡重悬玻璃奶，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。

18 9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥5～10min。
10．向管中加入15～50 µl（按最终产物浓度确定加入体积）Elution Buffer（10mM Tris，pH8.5）。涡旋震荡重悬沉淀，50℃水浴5min，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。 如果用水洗脱DNA，确定水的pH值在7.5～8.0之间。 11．小心将上清转入另一EP管中，上清即含纯DNA。约80～90%结合DNA被洗脱下来。

19 12. DNA产量和质量测定： 适当稀释DNA，测定A260及A280。按照计算公式计算DNA浓度： DNA浓度=吸光度260x50x稀释倍数mg/ml DNA纯度=A260/A280, ＞1.8表明样品核酸纯度＞90%。

20 注意事项： DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波紫外灯，切胶时间尽量短。
DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从玻璃奶上脱落而导致回收率降低。 最后洗脱前尽量去除管壁和管底残留的洗涤液，否则可能导致结合的DNA无法洗脱或洗脱液含有杂质，影响继后操作。

21 第二部分 质粒DNA的连接和转化

22 实验目的 了解重组DNA分子连接及转化大肠杆菌的原理与基本操作方法。

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24 一、DNA分子的体外连接

25 实验原理 DNA分子的体外连接：在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸基团与3’端羟基，使二者之间形成磷酸二酯键的生物化学过程。DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

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27 DNA连接酶 常用的DNA连接酶: DNA连接酶作用机理（T4 DNA连接酶为例）： 来自大肠杆菌的DNA连接酶
T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-ATP复合物。 酶-ATP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

28 T4 DNA ligase T7 DNA ligase
The T7 DNA ligase structure consists of two distinct domains with the ATP binding site formed by the larger N-terminal domain.  In the complex with ATP, the adenine ring is buried in a pocket in the enzyme with the alpha-amino group on the ATP close to the side-chain of lysine 34, with which it forms a covalent bond during the first stage of the reaction.  The conformation of the ATP suggests that, in the complex with AMP-DNA, the adenine residue would be ‘flipped-out’ of the DNA duplex, preventing it from interfering with base-pairing of the DNA in the region of the nick-site. T4 DNA ligase T7 DNA ligase

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30 注意事项 连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定。不同公司生产的DNA连接酶的最佳连接温度不同，对粘性末端与平末端的连接温度也不同。 连接效率：粘性末端效率高，平末端效率低，因而在底物浓度、酶浓度选择上存在差异。

31 提高连接效率的方法： 提高DNA的浓度，增加重组子比例。 缺点：会出现DNA自身连接问题，对于单酶切和平末端的DNA片段尤其如此。
解决方法：对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口在转化细胞后得以修复。

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33 提高连接效率的方法： 将连接液放置4℃过夜可以增加连接效果。

34 连接反应结果检测： 转化宿主菌，阳性克隆筛选。 DNA凝胶电泳。
The figure to the right depicts the effects of T4 DNA ligase. DNA fragments generated by digestion of a plasmid with two restriction enzymes were incubated with different amounts of ligase for varying periods of time, then electrophoresed in 1% agarose. Note that even after 5 minutes with ligase, essentially all the fragments have been ligated to one another, and shifted to higher molecular weights. Click on the image for details. This simple test is sometimes useful to check a tube of ligase suspected of being "dead".

35 实验材料： 纯化后的酶切质粒载体 目的基因片段 DNA Ligation Mix（Takara） T4 DNA 连接酶 缓冲液系统

36 方法和步骤 反应体系： 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心５秒。 24℃连接1-3小时。 反应结束后于-20℃保存。
线性化载体 pCDNA3 （EcoR I 和Xba I 酶切） µl（~0.1 µg） 3倍分子的目的基因p38片段 （EcoR I 和Xba I 酶切） µl DNA Ligation Mix µ 总体积 µl 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心５秒。 24℃连接1-3小时。 反应结束后于-20℃保存。 The optimal incubation temperature for T4 DNA ligase is 16C and when very high efficiency ligation is desired (e.g. making libraries) this temperature is recommended. However, ligase is active at a broad range of temperatures, and for routine purposes such as subcloning, convenience often dictates incubation time and temperature - ligations performed at 4C overnight or at room temperature for 30 minutes to a couple of hours usually work well.

37 二、重组DNA的转化及转化子的筛选

38 实验原理: 转化(Transformation)：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。
重组DNA转化：DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 感受态(Competence)：通过人工诱导的方法，使自然状态下无法发生转化的细菌，如大肠杆菌，处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态，从而使转化得以高效率地进行。 转化子(Transformant)：即转化后的受体菌,又叫重组子。重组子在培养环境中形成的克隆称为阳性克隆，外源DNA可在阳性克隆中大量扩增、繁殖、保存以及表达目的基因产物。

39 转化效率：105~107转化子/µg DNA。获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。
表达：供体基因随同复制子同时复制、分裂、转录翻译。 转化效率：105~107转化子/µg DNA。获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。

40 局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有：
发芽的芽孢杆菌容易转化； 大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； 适量的溶菌酶能提高转化率。 酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是： 蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； 细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现； 分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

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44 转化子的筛选方法： 插入失活法 抗性筛选 蓝白筛选(α互补法) 杂交筛选 免疫学筛选 酶切图谱鉴定 菌落PCR鉴定

45 常用方法： 抗性筛选法： 菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素、卡拉霉素等），这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 α互补法： 许多载体（如pUC系列 ）含有一个大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lac z基因)的短区段，其中含有lac z的调控序列和头146个氨基酸编码区，这个编码区中插入一个多克隆位点。而受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。当没有外源基因插入时，二者融为一体后，有β-半乳糖苷酶表达，它能水解培养基中生色底物—5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆位点，造成插入失活，从而使lac z基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同可以区分重组子和非重组子。

46 X-gal + IPTG + AMP with lacZ = blue colony

47 实验材料 LB培养基 质粒pCDNA3-p38连接产物（含Amp抗生基因） CaCl M Amp DH5α 大肠杆菌

48 感受态细胞制备 1. 将宿主菌DH5 大肠杆菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20h。
2. 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃震荡过夜。 3. 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37℃震荡培养4～5h，测A600达0.4～0.5。 4. 培养物冰上放置10min。 5. 转入一50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10min。 6. 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2，置冰上10min。 rpm 4℃离心10min，弃上清。 8. 加入300 µl 0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。

49 转 化 1. 在1.5ml Eppendorf管中加入100 µl感受态细胞和10µl pCDNA3-p38 DNA连接反应液，温和混匀，置冰上30分钟。 2. 42℃水浴45~60秒。 3. 立即冰浴2分钟。 4. 加入900 µl LB培养液，37℃孵育60分钟。 rpm 离心15秒，吸去800上清。用剩余200 µl上清轻柔悬浮细胞。 6. 接种转化的细胞。 7. 37℃培养12~16小时，观察结果。

50 注 意 事 项 1. 感受态细胞必须在冰上制备。 2. 所用液体和试管必须在冰上预冷。

51 细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。

52 实验五思考题： 如何计算DNA回收率？ 如何判断回收DNA片段的纯度？ 如何判断连接效果的成功性？ 简述T4 DNA 连接酶作用机理。
连接反应中应注意哪些问题？如何提高连接效率？ 如何计算感受态细胞的质粒转化效率？ 转化实验中为什么要设阴性对照？ 根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ 抗性筛选和互补筛选原理是什么？