革蘭氏染色法.

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1 革蘭氏染色法

2 目的 原理 材料與儀器 步驟與方法 實驗注意事項 實驗結果

3 目的 革蘭氏染色法為最常使用且最重要的細菌鑑別染色方法，此課程為教導同學了解革蘭氏染色法的原理學習、如何進行革蘭氏染色技術並利用革蘭氏染色方法來鑑別革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。

4 原理 革蘭氏染色法為目前微生物鑑別上最常使用之方法，是由19世紀丹麥病理學家Hans Christian Gram (1853 – 1938)在 in 1884所建立。其原理主要是依據細菌的細胞壁結構不同，利用染色之方法將細菌分為革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類。 染色之步驟可分為初染、媒染、脫色與復染等四大部分。

5 革蘭氏陽性菌因其細胞壁厚度較厚且具高度交聯化，富含胜聚醣 (peptidoglycan)，及台口酸(teichoic acid)故當初染後進行酒精脫色時，不易將初染的染劑顏色脫去，因此最終染色結果為依然保留初染劑的顏色－藍紫色；

6 革蘭氏陰性菌因細胞壁較薄、交聯度低且含較多的脂質成分，當進行酒精脫色時，細胞通透性增加，加上酒精溶解脂質的作用，使得初染劑易滲出，而後再經復染劑的染色後，革蘭氏陰性菌最終之結果則呈現復染劑之顏色－粉紅色。(Less peptidoglycan, more phosphate lipid)

7 材料與儀器 菌種 染色劑 設備儀器及其他用具 大腸桿菌(Escherichia coli)
腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) Vibrio: 弧; para: haemo:血 lyticus: 溶 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Staphyl : 葡萄 ; coccus: 球菌 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Bacillus: 長桿菌 染色劑 設備儀器及其他用具

8 染色劑 革蘭氏染色套組 Crystal violet (結晶紫染色液2%) Iodine (碘液) Ethanol (乙醇95%) (脫色)
Safranin (番紅染色液05%) (復染)

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10 設備儀器及其他用具 光學顯微鏡 接種環 載玻片 酒精燈 蒸餾水 濾紙 乳頭滴管

11 步驟與方法 此染色方法之操作流程如下：

12 玻片塗抹：取出載玻片，通過酒精燈之火焰，以乳頭滴管吸取蒸餾水滴1~2滴於玻片上，並將已滅菌冷卻後的接種環沾取上述兩種樣本菌，將菌體與玻片上之無菌水相互混合均勻至混濁。
乾燥：將玻片置於無菌操作台內自然風乾。 固定：將風乾後的玻片塗抹面向上，並迅速來回通過酒精燈上之火焰2~3次，以使菌體牢固的固定於玻片上後備用。 染色：革蘭氏染色法有以下4染色步驟：

13 初染：將製備好之玻片樣本置於染色架上，以1~2滴結晶紫染液染1.5分鐘，之後將染色塗抹面向下，以蒸餾水緩慢沖洗掉多餘的染液（圖4-2）。
媒染：將玻片上多餘的水分用濾紙吸乾，再加入碘液，靜置2分鐘後，將染色塗抹面向下，以蒸餾水緩慢沖洗掉多餘的碘液（圖4-3）。 脫色：將玻片上多餘的水分用濾紙吸乾，接著以95%之酒精進行清洗脫色，直至沖洗液之顏色由紫色轉變至無色為止(30秒)，然後再一次進行水洗（圖4-4）。此步驟為關鍵步驟，易影響實驗的結果。

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17 當觀察到沖洗液的顏色變為無色時即須立刻停止沖洗脫色（切勿脫色過度），由於脫色時間的長短受到多項因素之影響，故脫色時間的控制，需以人為的方式小心的進行。
復染：以濾紙吸乾水分，然後滴數滴沙黃染液於玻片上靜置一分鐘，之後進行最後一次水洗後吸乾。 光學顯微鏡觀察辨別其菌體型態：將玻片上之水分以濾紙吸乾，以光學顯微鏡進行鏡檢，並加以記錄顏色辨別菌體為革蘭氏陰性菌（紅色）或是革蘭氏陽性菌（紫色）。

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19 實驗注意事項 革蘭氏染色過程需進行三次染色及一次脫色步驟，每個步驟如稍有疏忽，皆可能會影響最終之實驗結果。
革蘭氏染色步驟中酒精脫色部分因對實驗結果有重大影響，故實驗進行時應特別注意。 每項染色步驟中，染劑用量需控制得當不宜過少，且應注意勿使染劑乾枯，當使用蒸餾水沖洗多餘染色液體後，應將殘留在玻片上之水滴吸去，再進行下一染色步驟。

20 革蘭氏染色不宜使用培養超過24小時之細菌進行染色觀察，以免影響最終之判定結果。

21 實驗結果 請畫出以革蘭氏染色法染色後之菌體，並以不同顏色來辨別革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。

22 E. coli S. aureus

23 Vibrio

24 Bacillus