Serine Protease and Its Inhibitor

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1 Serine Protease and Its Inhibitor
By 第四組

2 酵素基本反應機制 三個基本動作： 1、 Orientation 空間方向 2、 Acid-base transfer 化學轉移
3、 Bond Strain 構形扭曲

3 以上三種方式同時發生稱為協同式酵素催化 (concerted set)
例：Carboxypeptidase A ，羧肽酶 若先後依序發生，稱順序式酵素催化 (sequential mechanism) 例：Chymotrypsin ，胰凝乳蛋白酶

4 Chymotrypsin 胰凝乳蛋白酶 分子構造：含三條胜肽，由兩個雙硫鍵連接，是 轉譯後修飾 的產物；剛轉譯出來的完整胜肽鏈沒有活性，要在接近 N-端的 Arg 15 與 Ile 16 之間先斷開後，CT 才能活化。

5 E5-8 Chymotrypsinogen (inactive) 245 Trypsin p-Chymotrypsin (active)
R15-I16 p-Chymotrypsin S14-R15 T147-N148 Chymotrypsin 為何是由數條胜肽所組成？ 其實轉譯出來時是一條完整蛋白質，要先經過另一種蛋白脢 trypsin 在 R16-I16 之間切開，才產生活性；另有一裂解處在 Y146-A149，也會使得 chymotrypsin 具有活性。 為何蛋白質被切開後不會散掉？ 因為這些胜肽之間都以雙硫鍵連結著，仍然保持其三級構造以及正確構形。 L13 I16 Y146 A149 Disulfide bonds a-Chymotrypsin (active) E5-8

6 催化鐵三角 E5-15 Gly 193 His 57 Ser 195 Asp 102 Asp 194 +NH3 Ile 16
假若 沒有 Ile 16 的 N-端抓住 Asp 194，則 Ser 195 將無法擺在正確的立體空間位置，與 His 57 產生質子轉移作用；上圖以分子模型顯示此一關係。 催化鐵三角 E5-15

7 E5-10 - O–CH2 O C–O - = Ser H–N N H–O–CH2 195 C Asp 102 H CH2 His 57
C–O–H = N N–H C H CH2 Active Ser Chymotrypsin 活性區上面有三個極為重要的胺基酸，雖然原來在蛋白質長鏈上並沒連在一起 (57, 102, 195)，但經蛋白質摺疊後，卻湊在一起成為一直線。然後發生一件非常重要的事，就是 Asp 102 搶走中間 His 57 的氫，然後 His 57 去搶 Ser 195 的氫，最後 Ser 195 留下一個光禿禿的氧原子，而此氧原子因失去氫而變得極為活躍 (因為有多餘的負電荷)；這就是著名的催化鐵三角 (catalytic triad) 的形成。 E5-10

8 Catalytic triad 因為相鄰三個胺基酸基團的互相吸引，使 Ser 195 上的 -OH 質子被 His 57 搶走，而成為具有超強反應性的 -O -。此 -O - 攻擊目標蛋白質胜肽鍵上的碳 (carbonyl C+)，開始了順序式的胜肽鍵水解催化機制

9 Chymotrypsin 催化步驟大約分成兩段
(1) Acylation (2) Deacylation

10 E5-21 Chymotrypsin 催化機制 O - O C C O-H C O CH3–C–O– –NO2 CH3–C CH3COOH
Acylation O CH3–C–O– –NO2 Nitrophenol acetate O C CH3–C HO– –NO2 O - C Kinetics of reaction Deacylation (slow step) CH3COOH + H2O Time (sec) Nitrophenol O-H C Two-phase reaction 現在 已經知道 chymotrypsin 的催化機制分成 acylation 及 deacylation 兩個階段，其研究是利用 nitrophenol acetate 為基質所進行的；在早期的觀察中，發現催化生成 nitrophenol 的速率有兩個 phases，起先相當快放出 nitrophenol，然後變慢並一直維持此一速度。 利用兩階段式催化機制，可說明為何開始速率會比較快。 這是因為第一階段的 acylation 反應很快，而剛開始酵素都空閒著，一抓到基質就水解並放出 nitrophenol，因此黃色產物迅速上升。但是因為醋酸根還留在酵素上，準備進行第二步的 deacylation，而此一步驟相當慢速，即為 速率決定步驟 rate-limiting step；酵素要在加入水分子，釋出醋酸後，才能繼續吸入 nitrophenol acetate 繼續下一輪反應。因此出現了兩相的反應速率。 E5-21

11 Acylation 1、Substrate peptide 進入活性區
檢查專一性位置，確定水解位置 (aromatic amino acid)

12 2、Ser-O- 攻擊 peptide 上面的 carbonyl 碳，形成第一個過渡狀態。

13 3、Peptide bond 斷裂，His 57 供給氫離 子，放出 free peptide N (N-端那一半)

14 4、Peptide C 以 acylation 接在 Ser 195 上，成為中間產物

15 E5-22 ES -C-C-N-C-C-N-C-C-N- H H HO H HO H O -C N- H O -C-OH NH2-
Chymotrypsin 如何穩定過渡狀態？ 可利用活性區附近蛋白質骨架上的 -N-H，因為此氫原子稍帶正電，可中和過渡狀態上的高密度負電荷 (氧)。 Chymotrypsin 的兩個反應階段，都產生類似的中間過渡狀態，也都可以利用相似的方式來穩定之。 ES O -C-OH NH2- E5-22

16 Deacylation 1、水分子進入活性區，結合在 His 57

17 2、水分子的氧攻擊上述 carbonyl 碳，形成第二個過渡狀態，並把一個氫留在 His57

18 3、Ser 195 放出所連結的peptide，回復原來的活化狀態

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21 pH值對酵素活性的影響 E5-13 + pH 6 pH 7 H–N N–H C H H–N N C H H+ + Ser 195
His 57 Asp 102 H–O–CH2 O C–O - = H–N N–H C C-H CH2 H Inactive 上述 酸鹼度的實驗中，當 pH 由 7 降到 6 時 chymotrypsin 的活性急遽下降，是否有什麼胺基酸在這個改變的 pH 範圍中，產生很大的改變？ Chymotrypsin 是由胺基酸所組成，而其性質當然是由所組成胺基酸來決定。 回顧一下各種胺基酸的 pKa，在中性 pH 附近的只有 His 的 imidazole (6.0)，因此是否因為 pH 的改變影響 His 的帶電性質，因而造成活性的下降？ 的確，若把 pH 調到 6 以下，則催化鐵三角中的 His 將會多帶一個質子，而此質子將會加在吸引 Ser 195 質子的那個氮原子上，如此 His 將無法吸走 Ser 195 的質子，後者也就無法成為活性基團，只是個普通的醇基。 E5-13

22 pH Influences Chymotrypsin Activity
Relative Activity 早期 對 chymotrypsin 的觀察發現，其酵素活性受到酸鹼度的影響很大，酵素活性在大約中性時最大，往酸鹼兩方向都會降低活性，而且降幅極大。 為何 chymotrypsin 活性會受到 pH 如此大的影響？ 可以分成酸鹼兩個方向來探討，因為其機制不一樣。 pH E5-11

23 Inhibitor對酵素活性的影響 ※DIFP 會與其上的 Ser 195 反應，然後形成固定的鍵結，使得該酵素失去活性。 常見抑制劑：
TPCK (tosyl-L-phenylalaninechloromethyl ketone ) DIFP (diisopropyl-fluorophosphate) ※DIFP 會與其上的 Ser 195 反應，然後形成固定的鍵結，使得該酵素失去活性。

24 X E5-16 Chymotrypsin Ser195 Inhibited by DIFP Ser 195 Ser 195
Diisopropyl-fluorophosphate (DIFP) X O (CH3)2CH–O– P –O–CH(CH3)2 F = O (CH3)2CH–O– P –O–CH(CH3)2 = CH2 Ser 195 O-…H CH2 Ser 195 DIFP 與 Ser 型的蛋白脢有相當專一的作用，會與其上的 Ser 195 反應，然後形成固定的鍵結，使得該酵素失去活性。 因此，DIFP 是 chymotrypsin 的專一性抑制劑，也是其假基質 (pseudosubstrate)。 E5-16

25 Addition of Substrate Blocks DIFP Inhibition
Percent Inhibition of activity (%) 100 50 No substrate + DIFP X + DIFP & substrate Add substrate 假基質 DIFP 對 chymotrypsin 的抑制，可以被真的基質所對抗，因為兩者都是作用在同一個活性區上。 S Reaction time E5-17

26 Inhibitor - 沙林毒氣 沙林是一種神經毒氣，能使自主神經系統的交感神經與副交感神經立即失去平衡的毒氣。

27 國考題 62. Chymotrypsin 催化水解蛋白質的胜肽鍵，在催化官能基中，下列何者參與親核性催化機制？
(A) Histidine 57 (B) Aspartate 102 (C) Serine 195 (D) Cysteine 201

28 Chymotrypsinogen如何轉換成Chymotrypsin？ (A) 由protein kinase將Chymotrypsinogen磷酸化 (B) Chymotrypsinogen與cAMP結合 (C) Chymotrypsinogen與鈣離子結合 (D) Chymotrypsinogen經由蛋白水解 (proteolysis) (E) 由原本二聚體(dimer)聚合為四聚体(tetramer)

29 83. 何者是Chymotrypsin之非可逆性抑制？
(A) p-nitrophenyl acetate (B) Diisopropyl fluorophosphates (C) tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (D)EDTA

30 85. Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)為酵素chymotrypsin之抑制劑，是因DIPF與chymotrypsin內核者胺基酸做共價結合？
(A) Asp (B) His (C) Ser (D) Val ※催化鐵三角： His、Asp 、Ser