RNA Biosynthesis, Transcription

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1 RNA Biosynthesis, Transcription
第 十 一 章 RNA的生物合成 （转录） RNA Biosynthesis, Transcription

2 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 DNA 转录 RNA

3 转录与复制的相同点 都是酶促的核苷酸聚合反应 都以DNA 为模板 都需要依赖DNA的聚合酶 聚合的过程都是磷酸二酯键形成的过程
聚合方向（新链延长方向）都是：5’  3’ 都遵循碱基配对规律

4 复制和转录的区别

5 参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA
酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子

6 第一节 模板和酶 Templates and Enzymes

7 一、转录模板 结构基因：DNA分子上转录出RNA的区段。 5′···GCAGTACATGTC ···3′ 编码链
3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′ 模板链 转录 mRNA 5′···GCAGUACAUGUC ···3′ 翻译 N······Ala · Val · His · Val ······C 蛋白质

8 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。
相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。

9 不对称转录(asymmetric transcription)
在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。 结构基因 转录方向 5 3 3 5 编码链 模板链 模板链 编码链 转录方向

10 二、RNA聚合酶 (RNA-pol) DNA dependent RNA polymerase (DDRP) （一）原核生物的RNA聚合酶

11 核心酶可以进行转录，但不能在特定的起始点上开始转录。
核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme)        亚基的功能：辨认转录的起始点 核心酶可以进行转录，但不能在特定的起始点上开始转录。

12 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 原核生物的RNA聚合酶都受一类结核菌药物利福平或利福霉素的特异性抑制

13 亚基 目前发现多种因子 常规基因表达采用的是70（分子量70kD） 热休克反应： 细菌中:
当细菌受到热应激，则由32启动另一套转录，所生成的产物称为热休克蛋白（Hsp），Hsp编码的基因称为热休克基因（hsp） 真核生物中也存在热休克基因只是功能各异。

14 （二）真核生物的RNA聚合酶 RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA聚合酶

15 三、模板上酶的辨认、结合 原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。 53 35 结构基因 调控序列 RNA-pol 启动子(promoter)：RNA聚合酶结合模板DNA的部位

16 RNA聚合酶保护法

17 原核生物启动子保守序列 RNA聚合酶保护区 结构基因 5 3 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A
-30 -50 10 -10 -40 -20 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A A A C T G T T A T A A T Pu A T A T T A Py RNA-pol辨认位点 (recognition site) (Pribnow box) 原核生物启动子保守序列

18 顺式作用元件 结构基因 -GCGC---CAAT---TATA 增强子 GC盒 CAAT盒 TATA盒 转录起始 真核生物启动子保守序列

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20 The Process of Transcription
第二节 转录过程 The Process of Transcription

21 一、原核生物的转录过程 （一）转录起始 转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。
DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

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23 RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3
转录起始过程 1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合 2. DNA双链解开 3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物 5-pppG -OH + NTP  5-pppGpN - OH 3 + ppi RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 转录起始复合物:

24 （二）转录延长 1. 亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；
2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。 (NMP) n + NTP  (NMP) n PPi

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26 转录空泡(transcription bubble)：
RNA-pol （核心酶） ···· DNA ···· RNA

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28 RNA聚合酶 核糖体 原核生物转录过程中的羽毛状现象
DNA RNA 5 3 RNA聚合酶 核糖体 原核生物转录过程中的羽毛状现象

29 （三）转录终止 分类 指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。
依赖Rho (ρ)因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止

30 1. 依赖 Rho因子的转录终止 A T P Rho因子对RNA上的poly C 结合能力强 Rho因子有ATP酶活性和解螺旋酶活性

31 Rho因子转录终止的作用： 与RNA转录产物结合，使得Rho因子和RNA聚合酶都 可发生构象变化，从而使RNA 聚合酶停顿，解螺 旋酶活性使得DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从 转录复合物中释放

32 2. 非依赖 Rho因子的转录终止 DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。

33 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构
DNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` RNA UUUU...… UUUU...… 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构

34 RNA-pol 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿；
5´pppG 5 3 35 RNA-pol 使RNA聚合酶变构，转录停顿； DNA和RNA各自形成自己的局部双链，使杂化链更加不稳定，以致转录复合物趋于解体。 接着的一串寡聚U，则更是促进RNA新链从模板上脱落的促进因素。

35 二、真核生物的转录起始 （一）转录起始 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。

36 1. 转录起始前的上游区段 顺式作用元件(cis-acting element) 修饰点 切离加尾 翻译起始点 外显子 转录起始点 内含子
AATAAA 翻译起始点 外显子 转录起始点 内含子 转录终止点 增强子 TATA盒 OCT-1 CAAT盒 GC盒 OCT-1：ATTTGCAT八聚体

37 2. 转录因子 能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。

38 参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ

39 (pre-initiation complex, PIC)
3. 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。

40 TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物 POL-Ⅱ POL-Ⅱ PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化
由RNA-Pol Ⅱ催化转录的PIC TAF TBP ⅡB TATA ⅡA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物 POL-Ⅱ TFⅡF ⅡH ⅡE POL-Ⅱ ⅡH ⅡE TAF TBP CTD- P TFⅡF ⅡB TATA ⅡA PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化

41 4. 拼板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。

42 （二）转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。

43 转录延长中的核小体移位 核小体 RNA-Pol 转录方向 RNA-Pol RNA-Pol

44 （三）转录终止 —— 和转录后修饰密切相关。 真核生物mRNA带有聚腺苷酸尾巴的结构，这是转录之后加上的。
在模板链读码框架的3’端之后，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。

45 3加尾 RNA-pol 3 核酸酶 5 5 3 转录终止的修饰点 5 ------AAUAAA--
AAAAAAA······ 3 mRNA 3加尾 5------AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol 5 3 5 AATAAA GTGTGTG 3 转录终止的修饰点

46 Post-transcriptional Modification
第三节 真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification

47 几种主要的修饰方式 1. 剪接(splicing) 2. 剪切(cleavage) 3. 修饰(modification) 4. 添加(addition)

48 一、真核生物mRNA的转录后加工 （一）首、尾的修饰 5端形成 帽子结构(m7GpppGp —)
3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)

49 帽子结构

50 帽子结构的生成 5 pppGp… 5 ppGp… 5 GpppGp… 5 m7GpppGp… Pi
磷酸酶 Pi 5 pppGp… 加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5‘-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化 加帽出现在hnRNA中，说明可能在细胞核中完成，并在剪接之前。 5 GpppGp… pppG ppi 鸟苷酸转移酶 5 m7GpppGp… 甲基转移酶 SAM

51 加尾(adding tail)： 真核生物mRNA中poly A的出现是不依赖于DNA模板的。
加入poly A之前，先由核酸外切酶切去3’末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA。 3‘’端修饰也是在细胞核中，在剪接之前进行的。 Poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身的稳定性。

52 3’端修饰示意图

53 （二）mRNA的剪接 断裂基因(splite gene) C A B D
真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。 C A B D 非编码区 编码区 A、B、C、D

54 1. hnRNA 和 snRNA 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)
snRNA (small nuclear RNA)核内小RNA 核内的蛋白质 小分子核糖核酸蛋白体 （并接体, splicesome） snRNA —— hnRNA 剪接的场所

55 2. 外显子(exon)和内含子(intron)
在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。

56 鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰 鸡卵清蛋白基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA

57 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图

58 3. 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。 I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；
II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。

59 4. mRNA的剪接 —— 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。 snRNP与hnRNA结合成为并接体 ①

60 ② ③ E1 UG E2 UACUACA - AG U1、U4、U5 E1 UG E2 UACUACA - AG U4 U5 U6 U1

61 UpA GpU 外显子1 内含子 外显子2 剪接过程的二次转酯反应 第一次转酯反应 U-OH GpU pGpA 第二次转酯反应 G-OH
pG-OH (ppG-OH, pppG-OH) 第一次转酯反应 U-OH GpU pGpA 第二次转酯反应 G-OH UpU pGpA

62 5. mRNA的编辑(mRNA editing)
人类apo B基因 mRNA（14500个核苷酸） 肝脏 apo B100 （分子量为500000） 肠道细胞 apo B48 （分子量为240000） mRNA编辑 • RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。

63 二、tRNA的转录后加工 TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC DNA RNA pol Ⅲ tRNA前体

64 RNAaseP、内切酶

65 tRNA核苷酸转移酶、连接酶 ATP ADP

66 碱基修饰 （1）甲基化 如：A  Am （2）还原反应 如：U  DHU （3）核苷内的转位反应 如：U  ψ （4）脱氨反应
如：A  I （4）

67 三、rRNA的转录后加工 丰富基因：染色体上一些相似或完全一样的纵列串联基因单位的重复。 真核细胞的rRNA基因属于丰富基因。
45s的转录产物是三种rRNA的前体，经过剪接后形成核糖体小亚基的18S rRNA，其余形成5.8S及28S的rRNA。

68 基因间隔 rDNA 内含子 28S 5.8S 18S 转录 45S - rRNA 剪接 5.8S和28S-rRNA 18S - rRNA

69 四、核 酶 核酶(ribozyme) 具有酶促活性的RNA称为核酶。

70

71 四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式 四膜虫rRNA内含子的二级结构 5´-端核苷酸序列

72 除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。
最简单的核酶二级结构——槌头状结构 (hammerhead structure) 通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构 底物部分

73 核酶研究的意义 核酶的发现，对中心法则作了重要补充； 核酶的发现是对传统酶学的挑战； 利用核酶的结构设计合成人工核酶 。