RNA Biosynthesis, Transcription

Presentation on theme: "RNA Biosynthesis, Transcription"— Presentation transcript:

1 RNA Biosynthesis, Transcription
第 十 一 章 RNA的生物合成 （转录） RNA Biosynthesis, Transcription

2 The Central Dogma 复 制 转 录 翻 译 DNA RNA 蛋白质 逆转录

3 OVERVIEW 转录的概念； 复制与转录的异同点； 原核生物RNA聚合酶的组成结构特点； 真核生物RNA聚合酶的种类及特点；
原核生物及真核生物的启动子结构及特点； 转录的基本过程； 真核生物转录后的修饰.

4 复制和转录的相同点 均以DNA为模板 均需要依赖DNA的聚合酶 均以含三个磷酸的核苷酸为原料 均是酶促的核苷酸聚合过程，多核苷酸为产物
均遵从碱基配对规律 DNA 3’-ATGCATGC-5’ 5’-UACGUACG-3’ RNA A-U；G-C

5 复制和转录的区别 A - U ， T G C 配对 mRNA tRNA rRNA 子代双链 DNA （ 半保留复制） 产物 RNA 聚合酶（
pol ） 聚合酶 酶 NTP dNTP 原料 模板链转录（不对称转录） 两股链均复制 模板 转录 复制

6 参与转录的物质 原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA
酶: 依赖DNA的RNA聚合酶(RNA polymerase) 其他蛋白质因子

7 转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 转录 RNA DNA

8 第一节 模板和酶 Templates and Enzymes

9 一、转录模板 DNA分子上转录出RNA的区段。
DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。

10 5′···GCAGTACATGTC ···3′
编码链 3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′ 模板链 转录 mRNA 5′···GCAGUACAUGUC ···3′ 翻译 N······Ala · Val · His · Val ······C 蛋白质

11 结构基因 转录方向 5 3 3 5 编码链 模板链 模板链 编码链 转录方向

12 不对称转录(asymmetric transcription)
在DNA分子双链上某一区段，一股链用作 模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。

13 二、RNA聚合酶 原核生物的RNA聚合酶 RNA pol in PROK        核心酶 (core enzyme)
全酶 (holoenzyme)

14 各亚基的功能 a 36512 决定哪些基因被转录 b 150618 催化功能 b¢ 155613 结合 DNA 模板 s 70263
辨认起始点 亚 基 分 子 量 功 能

15 RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合

16 2 真核生物的RNA聚合酶 种类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 对鹅膏蕈碱 的反应 45S - rRNA hnRNA 5S tRNA snRNA 耐受 极敏感
中度敏感 转录产物

17 三、模板上酶的辨认、结合 原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。 53 35 结构基因 调控序列 RNA-pol RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。

18 RNA聚合酶保护法 目 录

19 原核生物启动子保守序列 RNA聚合酶保护区 结构基因 5 3 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A
-30 -50 10 -10 -40 -20 5  3  开始转录 -35 区 -10 区 T T G A C A A A C T G T T A T A A T Pu A T A T T A Py RNA-pol辨认位点 (recognition site) (Pribnow box) 原核生物启动子保守序列

20 +1 -10 +10 upstream start point downstream
● 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录） ● 从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为 转录单位 （transcriptional unit） ● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值 +1 -10 +10 upstream start point downstream

21 1 原核生物启动子(Promoter)的碱基组成
都含有两个保守的“一致序列”（consensus sequences）： (1)TATAAT 是Pribnow和Schaller在1975年发现的。位于转录起点上游10nt。又称为-10 region或Pribnow box。 特点：AT丰富，易于解链。 功能:与RNA polymerase紧密结合；形成开放启动复合体； 使RNA polymerase定向转录。 (2)TTGACA 位于转录起点上游35nt。又称为-35 region或Sextama box。与-10 region相隔16-19bp功能： RNA polymerase的亚基的识别位点；

22 转录开始的第一个碱基（+1）。原核生物中常为A或G，而且位置固定。

23 （1）TATA box（Goldberg-Hogness box）
2 真核生物启动子结构 （1）TATA box（Goldberg-Hogness box） T85A97T93A85A63A83A50 作用： 选择正确的转录起始位点；影响转录效率（容易解旋）。

24 （2） 上游元件（UPE） GC CAAT CT C T 能与转录因子CTF结合，控制起始活性。 C T GGGCGG GGG TTT
包括CAAT box、GC box等。 GC CAAT CT C T CAAT box一般位于-75bp左右。 能与转录因子CTF结合，控制起始活性。 C T GGGCGG GGG TTT GC box 一般位于-90bp左右。 被转录因子SP1识别，控制转录效率。

25 c. 顺式调节（调节同一条DNA上的靶基因）； d. 无物种和基因特异性（但有组织特异性）。
（3）远端控制区 1981年Benerji、Rusconi小组和Chambom等发现的。又称为远端上游序列（far upstream sequence）。 常见的是增强子（enhancer）。 作用特点 a. 具有远距离效应（一般位于上游-200bp） b. 无方向性和位置性； c. 顺式调节（调节同一条DNA上的靶基因）； d. 无物种和基因特异性（但有组织特异性）。

26 顺式作用元件 结构基因 -GCGC---CAAT---TATA 增强子 GC盒 CAAT盒 TATA盒 转录起始 真核生物启动子保守序列

27 The Process of Transcription
第二节 转录过程 The Process of Transcription

28 （一）转录起始 一、原核生物的转录过程 转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。
DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。

29 转录起始过程 （1）模板结合（template binding）：核心酶在因子的参与下与DNA形成非专一的、不稳定的复合物。
（2）起始识别：全酶与模板的启动子结合，形成封闭的酶-启动子二元复合物（closed binary complex） 核心酶 DNA  RNA pol全酶覆盖-55+20bp

30 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物
（3）全酶紧密结合在启动子的-10 region处，形成DNA局部变形的启动子二元复合物（open binary complex） -10bp序列熔解。 （4）酶移动到转录起点上，第一个NTP转录，因子释放，形成酶-启动子-NTP三元复合物（ternary complex）。 RNA pol覆盖-33  +20bp 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物 5-pppG -OH + NTP  5-pppGpN - OH 3 + ppi

31 转录空泡(transcription bubble)：
RNA-pol （核心酶） ···· DNA ···· RNA 目 录

32 目 录

33 RNA聚合酶 核糖体 原核生物转录过程中的羽毛状现象
DNA RNA 5 3 RNA聚合酶 核糖体 原核生物转录过程中的羽毛状现象

34 转录过程的电镜照片

35 （三）转录终止(termination)
指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。 原核生物DNA转录的终止处有特殊的序列和结构，称为终止子（terminator，T） 分类 依赖Rho (ρ)因子的转录终止(弱终子) 非依赖Rho因子的转录终止(强终子)

36 1. 依赖 Rho因子的转录终止 需要蛋白因子（rho factor）的帮助，才能终止转录。又称为依赖型终止子（Rho-dependent terminator）。 （1）因子的性质 依赖RNA的ATPase活性，和解旋酶活性。 表明是与RNA结合。 （2）依赖型终止有两种类型

37 ① 因子直接识别序列： 位于终止点上游，富含C，但缺乏G。 此区域缺失，将导致转录通读。 ② 依赖型终止序列
ACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCA 此区域缺失，将导致转录通读。 ② 依赖型终止序列 也形成茎环结构，但G-C含量少，易打开。 3’端没有寡聚A。

38 （3）终止方式 因子以6聚体形式结合在RNA上，沿着RNA合成的方向移动。 当RNA pol遇到不太稳定的终止序列茎环结构处，转录减慢。
因子追上RNA pol，（通过直接或间接作用）导致RNA-DNA分离。

39

40 2. 不依赖 Rho因子的转录终止 DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。

41 强终止子的结构特点 1. 有回文序列 2. 茎的区域富含G-C,
1. 有回文序列 转录出的RNA可形成茎环结构（stem-loop structure），使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整体上减弱了RNA 与DNA的互作。 2. 茎的区域富含G-C, 茎环不易解开。 3. 强终止子的3’端约有6个A 由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。

42 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构
DNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` RNA UUUU...… UUUU...… 茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构

43 RNA-pol 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。 5´pppG 5 3
35 RNA-pol 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。

44

45

46 二、真核生物的转录过程 真核生物的转录过程与原核生物相似，但有几处不同： 真核生物有3种RNA polymerase（原核生物只有一种）；
真核生物有3种不同的启动子以及相关元件； 真核生物的转录有很多蛋白介入； 真核生物的转录物一般还需要加工（RNA processing）。

47 1. 转录起始前的上游区段 顺式作用元件(cis-acting element) 修饰点 切离加尾 翻译起始点 外显子 转录起始点 内含子
AATAAA 翻译起始点 外显子 转录起始点 内含子 转录终止点 增强子 TATA盒 OCT-1 CAAT盒 GC盒 OCT-1：ATTTGCAT八聚体

48 2. 转录因子 能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。

49 参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ

50 (pre-initiation complex, PIC)
3. 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。

51 TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物 POL-Ⅱ POL-Ⅱ PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化
由RNA-Pol Ⅱ催化转录的PIC TAF TBP ⅡB TATA ⅡA TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物 POL-Ⅱ TFⅡF ⅡH ⅡE POL-Ⅱ ⅡH ⅡE TAF TBP CTD- P TFⅡF ⅡB TATA ⅡA PIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化

52

53

54

55

56 （二）转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。

57 核小体 转录延长中的核小体移位 RNA-Pol 转录方向 RNA-Pol RNA-Pol

58 （三）转录终止transcription termination
基因的3’端有终止信号；有涉及poly A加尾信号（AATAAA）； 5 AAUAAA-- AAAAAAA······ 3 mRNA 3加尾 5------AAUAAA- 核酸酶 -GUGUGUG RNA-pol 5 3 5 AATAAA GTGTGTG 3 转录终止的修饰点(加尾识别序列)

59 Post-transcriptional Modification
第三节 真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification

60 一、真核生物mRNA的转录后加工 1. 首、尾的修饰 5端形成 帽子结构(m7GpppGp —)
1. 首、尾的修饰 5端形成 帽子结构(m7GpppGp —) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)

61 帽子结构capping structure

62 帽子结构的生成 帽子的作用 1. 免受核酸酶的分解 2. 翻译时易被识别 5 pppGp… 5 ppGp… 5 GpppGp…
磷酸酶 Pi 5 pppGp… 5 GpppGp… pppG ppi 鸟苷酸转移酶 5 m7GpppGp… 甲基转移酶 SAM 帽子的作用 1. 免受核酸酶的分解 2. 翻译时易被识别

63 2. mRNA的剪接 1. hnRNA 和 snRNA 剪切的目的: 去内元(intron)
核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA) 核内的蛋白质 小分子核糖核酸蛋白体 （并接体, splicesome） snRNA 剪切的目的: 去内元(intron)

64 断裂基因(splite gene) C A B D
真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。 C A B D 非编码区 编码区 A、B、C、D

65 外显子(exon)和内含子(intron)
在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。

66 鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰 鸡卵清蛋白基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 目 录

67 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图
目 录

68

69 内含子真的含而不露? 否。酵母细胞色素氧化酶基因反式拼接的反式作用因子就是其内元的产物
外显子真的都显吗? 否。 1. tRNA、rRNA基因理所当然不显； 2. 一般基因前后两个外元不编码或部分编码氨基酸；锥虫反式拼接上去的外元就不编码任何氨基酸； 3. 人干扰素基因没有内元； 内元是真核生物的真质标记（Hall Marker）吗？ 原核生物T4噬菌体的1018个碱基就有内元。

70 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。 I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因；
II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索(lasso)结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。

71 mRNA的剪接 —— 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。 snRNP与hnRNA结合成为并接体 ① 目 录

72 ② ③ E1 UG E2 UACUACA - AG U1、U4、U5 E1 UG E2 UACUACA - AG U4 U5 U6 U1

73 (twice transesterification) 第一次转酯反应
UpA GpU 外显子1 内含子 外显子2 剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification) pG-OH (ppG-OH, pppG-OH) 第一次转酯反应 U-OH GpU pGpA 第二次转酯反应 G-OH UpU pGpA

74 mRNA的编辑(mRNA editing)
人类apo B基因 mRNA（14500个核苷酸） 肝脏 apo B100 （分子量为 ） 肠道细胞 apo B48 （分子量为 ） mRNA编辑 • RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。

75 3、tRNA的转录后加工 TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC DNA RNA pol Ⅲ tRNA前体 目 录

76 RNAaseP、内切酶 目 录

77 tRNA核苷酸转移酶、连接酶 ATP ADP 目 录

78 碱基修饰 （1）甲基化 如：A  Am （2）还原反应 如：U  DHU （3）核苷内的转位反应 如：U  ψ （4）脱氨反应
如：A  I （4） 目 录

79 4、rRNA的转录后加工 转录 剪接 rDNA 28S 5.8S 18S 45S - rRNA 5.8S和28S-rRNA
内含子 28S 5.8S 18S 转录 45S - rRNA 剪接 5.8S和28S-rRNA 18S - rRNA

80 四、核 酶 核酶(ribozyme) 具有酶促活性的RNA称为核酶。

81 四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式 四膜虫rRNA内含子的二级结构 5´-端核苷酸序列

82 E1 G 414 G I G E2 G 399 395 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ L19RNA 5´ 3´
OH 5´ 3´ G OH 414 5´ 3´ E1 E2 I 四膜虫RNA的自我剪接 G OH G 399 5´ 3´ L19RNA 具有催化活性的片段 5´ 3´ 395

83 除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。
最简单的核酶二级结构——槌头状结构 (hammerhead structure) 通常为60个核苷酸左右 同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构 底物部分

84 核酶研究的意义 核酶的发现，对中心法则作了重要补充； 核酶的发现是对传统酶学的挑战； 利用核酶的结构设计合成人工核酶 。

85 人工设计的核酶 粗线表示合成的核酸分子 细线表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭头表示切断点 目 录

86 思考题 1.何谓转录(transcription),何为转录单元(transcription Unit). 2.转录与复制的异同点.
3.原核生物及真核生物启动子的特点. 4.不依ρ因子的终止子(ρ-dependent terinator)的结构特点. 5.何谓顺式作用元件(cis-acting elements),何为反式作用因子(trans-acting factor),并分别举例说明. 6.真核生物转录后修饰有几种方式? 7.什么是基因,什么是断裂基因（splitting gene）?断裂基因是真核生物的真质标记(hall marker)吗? 8.何为核酶(ribozyme)?

87 9. 何为cDNA？它在体内是如何产生的？