电泳技术 （electrophoresis）

Presentation on theme: "电泳技术 （electrophoresis）"— Presentation transcript:

1 电泳技术 （electrophoresis）

2 本章主要内容 基本原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS-PAGE电泳 琼脂糖凝胶电泳 等电聚焦电泳
双向电泳

3 概 念 带电粒子在直流电场中的作用下，在一定介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移动的现象称为“电泳”
概 念 带电粒子在直流电场中的作用下，在一定介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移动的现象称为“电泳” 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术称为“电泳技术”

4 分 类 按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳（其中根据支持物的不同而有不同的名称如纸电泳，琼脂糖电泳等） 按电压分：低压电泳，高压电泳
分 类 按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳（其中根据支持物的不同而有不同的名称如纸电泳，琼脂糖电泳等） 按电压分：低压电泳，高压电泳 按用途分：分析电泳，制备电泳，定量免疫电泳 按支持物形状分：薄层电泳，平板电泳，圆盘电泳，毛细管电泳 按区带形式分：盘状电泳，火箭电泳

5 特 点 凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离，并可进行定性定量分析 样品用量少 设备简单 可在常温进行 操作简便省时 分辨率高

6 蛋白质电荷的来源

7 电泳的基本原理 带电粒子在电场中所受的力F=QE 所受阻力F’=6πrηv 电泳平衡时F=F’，则QE= 6πrηv
迁移率(电泳淌度)＝Q/ 6πrη,表示粒子在单位电场强度下的泳动速度 不同物质能否利用电泳进行分离，决定于两者迁移率的差别，有差别才能分离。电泳后分开的距离与迁移率、电压、时间等相关

8 影响电泳的因素 样品的性质 电场强度 缓冲液： (1)pH值 (2) 成分 (3)离子强度 支持介质：吸附、电渗，分子筛 温度

9 电 渗 （electro-osmosis） 在电场作用下液体相对于固体表面的移动称“电渗”

10 醋酸纤维薄膜电泳 （cellulose acetate membrane electrophoresis, CAME）
醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯 对蛋白质样本吸附少，分离速度快，时间短，电渗作用虽然高但很均一，不影响分离效果，经透明化处理后有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存 影响因素：膜的性质，缓冲液，电流和电压，电泳时间和温度，电泳槽的密封性能

11 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacryamide gel electrophoresis, PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide, Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在加速剂（TEMED）和催化剂（硫酸铵）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶

12 聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应

13 聚丙烯酰胺凝胶 特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹性、机械性能好 (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应 (3)对pH和温度变化较稳定 (4)几乎无电渗作用 ,只要Acr纯度高，操作条件一致，则重复性好 (5)样品不易扩散且用量少 (6)凝胶孔径可调节 (7)分辨率高

14 凝胶聚合的影响因素 空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，故聚合过程中反应液应与空气隔绝 某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应
某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度 温度升高聚合加快，温度降低聚合减慢

15 聚丙烯酰胺凝胶的性质 总浓度T%：100ml凝胶中含有Acr和Bis的总克数
T％越大，平均孔径越小，凝胶机械强度增加。但达15％时胶脆性增大，易断裂；T％过小则凝胶稀软不易操作 交联度C%：交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数 T%值固定时，C％＝5％时孔径最小，高于或低于5％时孔径相应变大。C%过大胶不透明，缺乏弹性；过小则凝胶呈糊状

16 分子量范围与凝胶浓度的关系

17 PAGE的分类 根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水平方向、垂直方向） 根据凝胶系统的均匀性分为：连续系统，不连续系统

18 PAGE圆盘电泳示意图

19 不连续圆盘电泳示意图

20 不连续电泳的物理效应 样品浓缩效应：凝胶孔径不连续 缓冲液离子成分不连续 pH的不连续性 分子筛效应 电荷效应
各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而得以分离

21 PAGE常见问题 凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因是硫酸铵失效，需新鲜配制；室温较低时聚合变慢，可调整硫酸铵和TEMED用量
指示剂向相反方向移动:电源连接错误，缓冲液选择错误 指示剂前沿呈“曲线”：“微笑”现象由凝胶冷却不均匀造成；“皱眉”现象多由电泳装置不合适、底部气泡或靠近玻片的凝胶聚合不完全引起

22

23 SDS-PAGE SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate），阴离子去垢剂

24 SDS-蛋白质复合物的形状

25 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖
优点：(1)含液体量大，达98％～99％，近似自由电泳，但样品扩散速度小，对蛋白质吸附极少 (2)分辨率高,重复性好 (3)电泳速度快 (4)透明,不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定 (5)区带可染色，样品易回收 缺点：含有较多硫酸根，电渗作用大 用途：用于核酸的分离、鉴定

26 等电聚焦电泳 （isoelectric focusing electrophoresis, IEFE）
当蛋白质迁移至其pI相同的pH处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的区带 蛋白质因其等电点的不同而得以分离

27 pH梯度的形成

28 IEFE的聚焦效应

29 常规PAGE与SDS-PAGE的区别

30 IEFE优缺点 优点:(1)分辨率高,可将pI相差0.01～0.02pH单位的蛋白质分开 (2)区带狭窄 (3)样品不管加到什么部位都可聚焦到其等电点 缺点:(1)需用无盐溶液，而无盐溶液中蛋白质易沉淀 (2)不适于在pI点不溶解或发生变性的蛋白质

31 双向电泳 又称二维凝胶电泳 第一相为IEFE，根据蛋白质电荷差异进行分离 第二相为SDS-PAGE，根据蛋白质分子量差异进行分离
分辨率极高，是蛋白质组研究的关键开门技术

32

33 转移电泳

34 其它电泳技术 脉冲场凝胶电泳 毛细管电泳 等等

35 完！