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小白鼠TSSK基因的抽取，純化，與表現 台大生化所 朱善德老師實驗室 891641 陳依文
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實驗目的 “TSSK”---Testis specific kinase----為由小白鼠testis表現的一種protein kinase,並且推定其substract為p90,因此,必須先將其由組織內純化,並表現其蛋白質product,才能觀察其與p90的反應是否能將p90磷酸化以便研究其進一步的功能與作用
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實驗方法 Primer的設計 所選用的vector為pET-21a,含有T7-tag,His-tag所以不在primer內加入stop codon. 以EcoR1與Xhol1為兩端的cutting site 抽mRNA 取小白鼠的testis搗碎取得
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實驗方法 RT-PCR 跑電泳確認PCR成果 Annealing溫度為56度
TSSK大小為900bp所以應在 之間看到major band
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實驗方法 Elution 挖下屬於TSSK的 band以便純化
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實驗方法 Ligation Transformation
將elute下來的DNA以restriction enzyme處理成sticky end 與vector ligate在一起 Transformation 把含有TSSK gene的vectortransform到E-coli內
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實驗方法 TSSK expression dosage
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實驗方法 Western
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實驗結果 TSSK的特性 作PCR反應時需要較高濃度的鎂離子以利其primer可以specific bind我們所需要的部分
Annealing溫度為５６度
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心得感想 實驗失敗不要氣餒 失敗時要確實檢討每一個步驟，以找出失敗的原因
Kit附的protocol只能參考參考，要實際做做看才知道到底是怎樣 欲速則不達
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