鼠肝DNA的制备 ——高分子量DNA的提取和纯化.

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1 鼠肝DNA的制备 ——高分子量DNA的提取和纯化

2 实验原理 DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础 研究遗传、疾病发生的基础 研究的前提：DNA的提取 以DNP、RNP形式存在。 策略：
1、破细胞----SDS破坏细胞膜 2、去蛋白----苯酚（蛋白变性剂） 3、除RNA----RNase

3 本实验用SDS、EDTA ，在Tris-HCl存在的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚并使细胞内存在的DNA酶失活，然后用苯酚—氯仿有机溶剂多次抽提后，用乙醇沉淀得到纯化的DNA。
DNA大小为100－150kb 。

4 试剂作用 裂解缓冲液：Tris-HCl pH7.8 维持pH恒定，防止DNA变性和水解；EDTA能络合二价金属离子，当Mg2+被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。

5 Phenol、Chloroform 、 Proteinase K and RNase
Proteinase K：蛋白酶K，能水解与DNA结合的核蛋白以及细 胞质中会降解DNA的酶。可与EDTA、SDS合用。 RNase：去除RNA

6 实验操作：样品准备 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上 提取，应贮存－70℃或液氮 组织匀浆法

7 实验操作（1）： + 20%SDS 25ul； +2.5V冰乙醇； EDTA 30ul； 0.1MNaCl PK 20ul 鼠肝匀浆液
1mlTE溶解 +2.5V冰乙醇； 0.1MNaCl 白色絮状沉淀 70% 乙醇洗涤 +RNase 20ul +等体积苯酚：氯仿 10000rpm，5min 鼠肝匀浆液 1/3管匀浆液 水相 轻缓混匀 塑离 刻度离心管 37℃ 30min 50℃ +等体积酚：氯仿 颠倒混匀 20%SDS 25ul； EDTA 30ul； PK 20ul

8 实验操作（2）： 取1.5ul，OD260/OD280比色 PCR 纯度、浓度、总量 沉淀加0.3-0.5mlTE溶解 定性、定量
70% 乙醇洗涤 白色絮状沉淀 余原液

9 白色絮状沉淀 Precipitated DNA molecules appear as
long pieces of fluffy, stringy, web-like strands.

10 注意事项 1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须：
(1) 匀浆时应保持低温(冰浴中)，匀浆时间应短(30秒／次，2次)，勿用玻璃匀浆器。 (2) 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。 (3) 苯酚-氯仿抽提时勿剧烈振摇。 2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。 3.苯酚是一种强烈的蛋白变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛苯酚的试剂瓶、离心管盖紧。 4.离心管配平；滴管、移液枪的使用。

11 DNA的鉴定—紫外分光光度法 1、鉴定纯度 在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，OD260与OD280之比应在1.75－1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值表明有RNA残留。 纯DNA的A260/A280应为1.8（ ） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，A260/A280＜1.6 若溶液中含有RNA， A260/A280＞2.0

12 测定DNA在260nm的光吸收，计算浓度：g/ml OD260nm×稀释倍数×50 g/ml ×1/光径
2、含量计算 测定DNA在260nm的光吸收，计算浓度：g/ml OD260nm×稀释倍数×50 g/ml ×1/光径 = g/ml（双螺旋DNA ） 计算： DNA纯度 DNA含量 DNA总量 1 OD相当于: 50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸

13 分离提纯核酸的最基本要求 保持核酸分子一级结构完整性和纯度。 完整性： 防止变性（温度、pH）
防止外界机械性损伤（动作轻柔、钝口滴管） 完整性： 防止变性（温度、pH） 防止降解（DNase、匀浆低温、EDTA） 纯度：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金 属离子； ②蛋白质、糖、脂等其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。

14 加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺
DNA的变性与降解的区别 起因 断裂键 是否可逆 理化性质变化 变性 加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺 氢键 是 增色效应 粘度降低 降解 酸碱、DNase 磷酸二酯键 否 分子量降低 鉴别：电泳

15 DNA的贮存 1. 短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA，pH8）缓冲液中。 2. 长期贮存：
3. 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0

16 思考题 P70： 3、4 请说出实验中所用各试剂的作用？ 在实验中应如何注意控制DNA的纯度？若OD260/280＜1.6，该如何处理？

17 预习：实验15 准备题目： 1. PCR技术的原理。 2. β-actin基因的作用。 3. PCR反应体系中各成分的作用。
4. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的原理。