第十三章 DNA的生物合成 第一节 DNA复制的概况 第二节 原核生物DNA的复制 第三节 真核生物DNA的复制 第四节 逆转录作用

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2 第十三章 DNA的生物合成 第一节 DNA复制的概况 第二节 原核生物DNA的复制 第三节 真核生物DNA的复制 第四节 逆转录作用

3 DNA的生物合成： RNA的生物合成： 蛋白质合成：以mRNA为模板合成 以DNA为模版的，即DNA复制；
以RNA为模版，即RNA复制； 蛋白质合成：以mRNA为模板合成

4 第一节 DNA复制的概况 一、DNA复制的概况 三、真核生物的DNA复制 （一）DNA复制的通则 （二）DNA复制的起始与复制方式

5 （一）DNA复制通则 1 DNA合成的模板－－亲代DNA 作为信息分子，DNA的合成必需在模板的指导下完成。
DNA是遗传信息的载体，在合成DNA时决定其结构特异性的遗传信息只能来自其本身，因此必需由原来存在的分子为模板来合成新的分子，称为自我复制（self-replication），即DNA指导的DNA合成。

6 2 碱基配对是模板DNA信息传递的基础 Watson－Crick提出的DNA双螺旋复制模型。模板链通过严格的碱基配对原则指导子代DNA的合成，该原则由DNA指导的DNA聚合酶执行，新合成的子链与模板链反向平行互补。

7 3 DNA的复制是半保留的 1958年 Meselson和 Stahl
DNA以亲代DNA链为模板，复制时模板双链解开形成单链，按照单链DNA的核苷酸顺序，严格按照碱基配对的原则合成新链，新合成的DNA分子与原DNA分子碱基顺序完全相同，每条子代DNA的一条链来自亲代，一条是重新合成的，这种复制方式称为半保留复制。 1958年 Meselson和 Stahl

8 4 DNA复制为双链复制型 DNA由两条DNA链盘绕形成，每条单链都含有其互补链所必需的全部遗传信息，故每条单链均可以作为模板。

9 （二）DNA复制的起始与复制方式

10 2.1 复制子与复制起点 复制子(replicon):基因能够独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都含有固定的起点。
原核生物DNA和质粒以及真核生物细胞器DNA均为环状DNA，通常都为一个复制子，只有一个复制起点；真核生物DNA含有多个复制子，因而具有多个复制起点。 复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，它即继续下去，直到整个复制完成或复制受阻。

11 2.2 复制方向与复制叉(replication fork)
对于环状DNA分子，复制从固定的起始点开始，通常向两个方向进行复制，且大多数情况下复制是对称的。

12 2.3 复制方式 直线双向（单个起始点，双向复制） 直线单向 （多个起始点，单向复制） θ复制（固定起始点，单向或双向对称复制）
滚环复制（单个起始点，单向不对称复制） D环复制 值得注意的是，无论那种方式，都是双链复制（RF型

13 θ复制 环形染色体复制时形成θ的结构，两条链同时复制。

14 二、原核生物DNA复制 （一）参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质 1.DNA聚合酶 DNA复制过程中最基本的酶促反应是4种脱氧核苷酸的聚合反应。 1956年,从大肠杆菌中分离出催化该反应的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I(DNA polyerase I,pol I)。

15 从分子组成上看，DNA分子是由核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键连接而形成的多聚核苷酸，因而核酸的生物合成从化学角度看是核苷酸的聚合过程。
5´ 3´ 从分子组成上看，DNA分子是由核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键连接而形成的多聚核苷酸，因而核酸的生物合成从化学角度看是核苷酸的聚合过程。 在大肠杆菌中DNA聚合酶负责核酸链的延伸。

16 1. DNA聚合反应及DNA聚合酶 DNA聚合酶的特点 大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在

17 dNTP是DNA链聚合的原料 该反应由DNA聚合酶催化，核酸的构建分子为dNMP，而其底物为dNTP，可将dNTP理解为dNMP的活化形式。

18 需要引物,引物为RNA 所谓引物就是指和模板链互补的一线性片段，其上带有能与核苷三磷酸相结合的游离3’羟基，称为3’羟基末端或引物末端，核酸链由此延伸。

19 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在
需要模板 需要引物 具有5’ 3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 可以使得碱基错配率减小至（1/104－105）

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21 DNA合成总是沿着5’3’的方向进行

22 DNA的延伸：单一的DNA链作为模板，引物链必需具有3’羟基末端，在此处一个新的核苷酸单元被加入。每个被增加的核苷酸部分通过碱基配对被模板上合适的核苷酸选择，反应产物具有新的游离的3’羟基末端，允许另一个核苷酸加入。

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24 大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在 需要模板 需要引物
具有5’ 3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 具有3’ 5’外切酶活性，有纠正作用 可以使得碱基错配率减小至（1/104－105） 可使得DNA复制的精确性提高102－103倍

25 DNA聚合酶Ⅰ的外切核酸酶活性校正

26 在聚合酶继续前进之前，胞嘧啶经历由C*到C的互变异构转变，新的核苷酸被错配
是胞嘧啶C的罕见的互变异构型，与A配对，被掺入生长链 在生长链错配的3‘-OH端阻碍链的延伸。DNA聚合酶后滑，3’-5’外切酶活性部位滑到错配碱基位置 错配的核苷酸被去除 DNA聚合酶继续向前滑动，恢复聚合活性

27 大肠杆菌DNA聚合酶的特点 以四种dNTP作为底物，反应需要Mg2＋存在 需要模板 需要引物
具有5’-3’方向的聚合能力，其活性中心对碱基配对具有严格选择性 具有3’-5’外切酶活性，有纠正作用 具有5’-3’外切酶的活性 ，可用于切除引物

28 大肠杆菌DNA聚合酶的种类 DNA聚合酶Ⅰ： DNA聚合酶Ⅱ： DNA聚合酶Ⅲ：

29 大肠杆菌DNA聚合酶的比较 DNA聚合酶的类型 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 结构基因 polA polB polC 亚基数 相对分子量 3′–5′外切酶活性
1 ≥7 ≥10 相对分子量 103 88 830 3′–5′外切酶活性 有 5′–3′外切酶活性 无 聚合速度（核苷酸/S） 16～20 40 250～1000 连续聚合能力（核苷酸） 3～200 1500 ≥

30 DNA聚合酶的分工 DNA聚合酶Ⅰ：切除RNA引物或有损伤的DNA片段，并用正确的DNA片段填补 DNA聚合酶Ⅱ：主要参与DNA的损伤修复 DNA聚合酶Ⅲ：主要的复制酶，负责DNA链的延伸

31 Ⅲ DNA聚合酶Ⅲ的聚合作用

32 DNA聚合酶Ⅲ的结构

33 DNA链延长的半不连续性 DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体结构保证了DNA复制过程中两条模板链复制的同步性。
前导链（leading strand）：复制时，DNA的一条链按与复制叉移动一致的方向，沿5’3'方向连续合成。 后随链（lagging strand）：另一条链是在已经形成一段单链区后，先按与复制叉移动的相反的方向，沿5’3'方向合成冈崎片段，再通过连接酶将冈崎片段连在一起构成完整的链。

34 DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体结构保证了DNA复制过程中两条模板链复制的同步性。

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36 Ⅳ DNA聚合酶Ⅰ负责切除引物

37 后随链中的RNA引物被DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切核酸酶活性切除，并通过同样的酶催化合成DNA取而代之。

38 Ⅴ 连接酶负责封闭切口 与模板配对的一段DNA或RNA可同时被DNA聚合酶Ⅰ上的5’-3’外切酶降解和替换。酶的这些活性对复制过程中的DNA修复和RNA引物的去处均有作用，DNA链平移切口被连接酶封闭。

39 2. 参与原核DNA复制的其他酶和蛋白质 解旋酶:使双螺旋DNA解链 引物酶:合成RNA引物 单链结合蛋白（SSB）:稳定单链区 DNA连接酶:连接DNA片段末端 DNA旋转酶（DNA拓扑异构酶）:引入或松解超螺旋

40 DNA聚合酶Ⅲ（含Mg离子）：负责DNA链的延伸 DNA聚合酶Ⅰ：切除引物并填满缺口 DNA连接酶：连接DNA片段末端
单链结合蛋白（SSB）：稳定单链区 引物合成酶：合成RNA引物 DNA聚合酶Ⅲ（含Mg离子）：负责DNA链的延伸 DNA聚合酶Ⅰ：切除引物并填满缺口 DNA连接酶：连接DNA片段末端

41 DNA旋转酶与DNA解旋酶共同作用使DNA双链解旋
第一步： 复制的起始 DNA旋转酶与DNA解旋酶共同作用使DNA双链解旋

42 原核生物DNA的合成 第一步： 复制的起始 第二步：DNA链的延长

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47 原核生物DNA的合成 第一步： 复制的起始 第二步：DNA链的延长 第三步：DNA合成的终止

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49 DNA复制完成后两个子代分子以连环体的形式存在，需要拓扑酶切开。

50 DNA复制视频

51 第三节 真核生物DNA的复制

52 真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处： 多复制起点
至少有五种聚合酶αβγδε 端粒的复制依赖于端粒酶 α β γ δ ε 亚基数 4 2 5 分子量（KD) ＞250 36-38 170 256 细胞内定位 核 线粒体 5′→3′聚合活性 ＋ 3′→5′外切活性 － －  功能 复制、引发 修复 复制

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54 原核生物与真核生物DNA复制的差异 原核生物 真核生物 复制起点 单个 多个 复制叉的移动速度 900 nt/s 50 nt/s
冈崎片段的大小 nt nt 引物酶 有 由DNA pol α的两个小亚基承担 复制周期 可重叠 不可重叠 末端缩短 不存在 存在 （端粒酶）

55 第四节 逆转录作用

56 逆转录作用 催化逆转录过程的酶为逆转录酶（RT）。
以RNA为模板合成DNA，与转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，称为逆转录（reverse transcription）。 催化逆转录过程的酶为逆转录酶（RT）。

57 逆转录酶在分子生物学中的应用 cDNA的合成：
以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链(complementary DNA,cDNA)。 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

58 第五节 DNA的损伤与修复

59 DNA损伤与突变 损伤可造成突变或致死 突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。 损伤原因 物理（紫外、高能射线、电离辐射） 化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物） 生物因素（碱基对置换、碱基的插入/ 缺失造成移码）

60 突变与损伤： 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。
在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。

61 DNA的修复系统 一、直接修复 二、切除修复 三、重组修复 四、应急反应（SOS）和易错修复

62 一、直接修复（光修复）

63 光复活（photoreactivation）
可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。 是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。

64 当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。

65 二、切除修复

66 切除修复（excision repair）
即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。

67 三、重组修复

68 重组修复（recombination repair）
又称复制后修复（postreplication repair） 受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重组修复。

69 四、SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair ）。

70 DNA重组和克隆 DNA重组： 同源重组（homologous recombination）：
位点特异性重组（site-specific recombination）： 将两个短的DNA特定序列（即特异位点）之间的基因从染色体上切除或组合到染色体另一个特定位点。

71 基因克隆的基本步骤

72 PCR的原理与流程 PCR即聚合酶链式反应，也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。
其原理为：靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适的条件下，由耐热的Taq DNA聚合酶催化引物由5’－3’扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。 每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。 经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。

73 PCR的主要步骤： • 模板DNA的变性：一般选用95℃左右1 min，使DNA双链解为单链；
• 循环数：按初始模板浓度确定，一般25－45之间。

74 基因克隆中的工具酶： 限制性内切酶：能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶
分布：主要在微生物中。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400～500多种。

75 基因克隆中的载体： 载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒的特点: 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；
质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； 质粒的存在对宿主细胞无影响； 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。

76 内容小结 一、DNA复制是半保留复制、半不连续复制
二、原核生物DNA的复制的特点是1.原核只有一个起始位点。2.原核复制起始位点可以连续开始新的复制，特别是快速繁殖的细胞。3.原核的DNA聚合酶III复制时形成二聚体复合物。4.原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性。 三、真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同点为1.多复制起点 2.至少有五种聚合酶αβγ 3.端粒的复制依赖于端粒酶 四、逆转录酶及其在分子生物学中的作用 五、DNA的损伤是由DNA突变所造成的，修复包括直接修复、切除修复、重组修复与启动紧急反应修复（SOS） 六、DNA重组包括同源重组和位点特异型重组；DNA克隆的PCR技术包括变性、复性及延伸多个循环。

77 参考书目 生物化学原理.杨荣武主编，北京:高等教育出版社出版，2012.
生物化学简明教程（第四版）.罗纪盛等主编，北京:高等教育出版社出版,2009. 生物化学（第三版）.王镜岩、朱圣庚等主编，北京:高等教育出版社 生物化学.张部昌主编，合肥：安徽教育出版社，2010. 基础生物化学.陈惠主编，北京:中国农业出版社，2014. Nelson D L, lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman,2004.