蛋白质组学(proteomics) 的相关技术及应用

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1 蛋白质组学(proteomics) 的相关技术及应用

2 蛋白质组学 蛋白质组学的含义 蛋白质组学种类 蛋白质组学研究的相关技术 蛋白质组研究的基本技术路线

3 蛋白质组学的含义 蛋白质组(Proteome):最早由澳大利亚学者Wikins等于1994年提出,指的是由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有protein。蛋白质组是一个动态的概念。 蛋白质组学(proteomics):则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等。其目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁。

4 蛋白质组学与基因组学 基因组(genome):指细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。基因组是一个相对静态的概念。 基因组学(genomics) :是研究生物基因组的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的科学。利用遗传图、物理图、全序列图可以精确定位基因内部序列结构与所有基因间隔序列。

5 蛋白质组学种类 表达蛋白质组学： 结构蛋白质组学：
其目标是研究细胞或组织在不同条件，如药物或疾病状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等，其运用技术主要依赖双相凝胶电泳技术以及图像分析系统, 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。 表达蛋白质组学： 其目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之间相互作用的改变可能引起人类疾病，因此蛋白质之间的相互作用在识别新的药物干预靶点方面有很大的潜力。 结构蛋白质组学：

6 蛋白质组研究的基本技术路线

7 蛋白质组流程图

8 蛋白质组学研究的相关技术 双向电泳技术 质谱 蛋白质组中生物信息学

9 双向电泳技术 双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis ， 2DE)是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一，由Farrel等人于1975年建立。它是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术。双向电泳技术能同时将上千种蛋白质同时分离和展示,也是目前分析复杂组份蛋白质分辨率最高的工具。

10 1 基本原理 第一向：pH梯度等电聚焦,因为蛋白质是两性分子,具有不同的等电点,在pH梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。IEF时，在电场的作用下，蛋白质将移向其静电荷为零的点，静电荷为正的蛋白将移向负极，静电荷为负的将移向正极，直到达到等电点，这就是IEF的聚焦效应。 第二向：根据分子量不同进行分离，此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂，它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电，所带电荷与蛋白质的分子量成正比，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。

11 2DE 基本原理图示

12 2 双向电泳的技术方法 蛋白样品制备 等电聚焦 IPG 胶条平衡 SDS-PAGE 染色

13 2DE 基本流程图

14 蛋白样品制备 样品制备主要包括溶解、变性、还原等步骤, 以充分破坏蛋白质之间的相互作用, 并同时除去其中的非蛋白质组分如核酸等。
(1) 细胞培养、处理和收集； (2) 将细胞在 IEF 裂解缓冲液中溶解 (3) 将样品离心以去除不溶的细胞碎片和 DNA ，提取上 清， -80 ℃保存。

15 样品制备原则 1.尽可能多地使细胞或组织中的蛋白溶解，包括多数疏水性蛋白（变性剂、表面活性剂、还原剂）
2.防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 3.完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 4.避免蛋白质被修饰得到错误的关于其等电点的信息 5.防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等） 6.为富集特定的蛋白,可以采用不同的样品处理方法 7. 蛋白质样品与第一向电泳的相容性

16 不同的样品处理方法 组织细胞:低渗、匀浆、超声、反复冻融等
体液成分(如血清、腹水、尿液等):仅需经过稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳 植物组织:先采用冷丙酮及三氯乙酸沉淀蛋白质，不仅有效抑制了蛋白酶对蛋白质的水解作用， 而且除去了色素、酚等干扰双向电泳的物质 Dnase、RnaseA来降解核酸 二次样品制备

17 双向电泳的技术图

18 等点聚焦（IEF） IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。
根据建立pH 梯度原理不同分为：载体两性电解质pH 梯度和固相pH 梯度。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质的一部分 根据电泳方式不同分为：管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。 根据支持介质的不同：① ISO – DALT：在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度。 ②IPG – DALT：使用丙烯酰胺和固相化的两性电解质共聚,可形成具有pH梯度的凝胶，是现在主要和常用的方法。③非平衡pH梯度电泳

19 蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c + 蛋白质分子在负极端 蛋白质分子在正极端
蛋白质样品中各组分聚焦成区带 + —

20 等点聚焦（IEF）

21 IPG 胶条平衡 胶条由一向转移到二向之前,必须进行平衡,目的主要是进行蛋白质的烷基化以及让电泳介质达到与二向SDS-PAGE相同的缓冲体系。烷基化的目的是对蛋白质自由巯基进行修饰,使断开的二硫键不会再重新形成

22 SDS - PAGE SDS – PAGE：利用蛋白質分子量大小的不同，使其在电泳中分离。
第二向SDS - PAGE在恒温下进行,一般采用1. 5～1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶,进行5～8小时左右。起始时用低电流或低电压,样品在完全走出一向胶条时,再加大电流(或电压) ,待指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

23 SDS - PAGE

24 染色 银染法：灵敏度高，可以在电泳图中找到含量较低的蛋白，所需的上样量较少（每点仅需0.1 ng），可以检测到小于1ng的蛋白点，但线性范围小于2个最高数量级。对温度依赖性大，而且需要精确控时的操作 考马斯亮兰：灵敏度较低，检测限度约为每点10ng蛋白，但可以染色多种蛋白质，并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。 荧光染色法：一种终点染色方法， 可以检测到大约1 ng 的蛋白点。荧光染色法与蛋白量呈3 个最高数量级的线性 关系，需用荧光扫描仪显示用荧光染色法染色的蛋白点。

25 图像分析及数据处理 将染色后的凝胶放在 GS-710光密度扫描仪上，扫描后的图像用 PDQUEST 2D 软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。 大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片

26 应用 双向电泳技术在蛋白质组学中发挥着重要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。2-DE凝胶图谱斑点是以计算机为基础的图像分析软件,包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建等在内的图像分析,将凝胶上的斑点数字化,根据标准蛋白即可以获得关于被检测蛋白其等电点和分子量的信息,从而用于建立数据库。2-DE技术还广泛应用于医学领域的研究工作,如通过斑点对比,寻找差异蛋白,从而发现疾病相关蛋白,寻找用于诊断的疾病相关标记分子,寻找疾病相关的蛋白质药靶,以用于药物设计,研究疾病的致病机理等。蛋白质的翻译后修饰和加工亦可通过双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图确定。

27 质谱

28 质谱简介 Mass Spectra ↓ ↓ 质量 光谱 ↓ 片段→分析→谱图→“质量”

29 原理 质谱用于结构分析有点像： 分析基本原理： 样品分子离子化后，根据不同离子间的质荷比(m/z)的差异来分离并确定分子量。

30 具体流程 ? Many Spectra ? Purification Digestion Sample Mass Measurer
Serum Albumin Myosin Cytochrome C Escheria Coli …. ? Identification Many Spectra

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32 应用 小分子有机物质的检测 有机大分子物质的检测 新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化。

33 蛋白质组信息学 生物信息学已经成为当代生物学和医药学的组成部分,用于巨量生物信息资源的收集、存储、处理、搜索、利用、共享、服务、研究和开发。它常由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。在基因组计划中它已经发挥了不可取代的作用, 而在蛋白质组计划中也日益成为强力的支撑。不过, 蛋白质组比基因组具有更大的复杂性, 因而蛋白质组信息学更有挑战性。

34 蛋白质组比基 因组具有更大的复杂性 基因组是内禀的和固定的, 蛋白质组则是随发育阶段、驻留组织甚至所处环境的变迁而变化的。
98% 的人类疾病是多基因的和/或后成的(polygenic, epigenetic) , 疾病的诊断和治疗的选择可能完全依赖于后成的调节以及患者所处的环境。 组织中mRNA 的丰度与蛋白质的丰度的统计相关是不显著的, 例如Anderson等用人肝细胞测得的相关系数是0.48。 几乎所有的蛋白质都会经受翻译后修饰,从水解切割到特异残基的共价修饰, 仅后者就有200 多种之多。因此, 蛋白质信息学的内容与配置有很多特殊之处。

35 蛋白质组的交互网

36 Figure 3-35. Three levels of organization of a protein
Figure Three levels of organization of a protein. (Alberts - Molecular Biology of the Cell)

37 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

38 Protein Structure Figure Three levels of organization of a protein. (Alberts - Molecular Biology of the Cell)

39 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

40 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

41 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

42 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

43 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

44 联邦数据库 各实验室建立蛋白质组数据库的技术和体制往往是不完全相同的, 但可在因特网上超文本连通, 形成联邦数据库.

45 谢谢