Negative staining 陰性 (負)染色法

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1 Negative staining 陰性 (負)染色法
12th chapter P 73

2 目的 學習如何將微生物進行玻片塗抹製成樣本，並藉由進行細菌的簡單染色法及陰性染色法之方式，來觀察微生物之菌體形態，藉以了解微生物染色之目的及原理。

3 原理 陰性染色法與簡單染色法相反，其原理為利用帶有負電荷的酸性染料如墨汁及尼羅辛染劑進行染色，由於菌體本身帶負電之關係，會與負電荷的酸性染劑互相排斥，故菌體並不會染上顏色，因此未經染色之細菌即可藉由染色後之背景而顯現出來，藉此觀察其大小與型態，由於此種染色之方法並非針對細菌菌體本身而是針對其背景進行染色，故又稱為間接染色法。 常用的染色劑為印度墨水 (India ink)或苯胺黑(Nigrosine)。 Similar with capsule staining.

4 材料與儀器 Bacteria Staining agent 大腸桿菌(Escherichia coli)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Staining agent Nigrosine An acidic stain which can not be stained onto bacterial cell membrane which contain negative-charged particles.

5 設備儀器及其他用具 光學顯微鏡 酒精燈 載玻片 接種環 蒸餾水 染色架 濾紙 75%酒精 乳頭滴管

6 步驟與方法 陰性染色法

7 陰性染色法 此染色方法之操作流程如下：

8 染色：將製備完成之玻片樣本置於染色架上，加上一滴染劑，在加上一滴水，以接種環於塗抹菌體於染色液中，靜置約3~5分鐘，使菌體上色。
玻片樣本製作：玻片樣本製作有以下4步驟： 玻片塗抹：取出已經消毒之載玻片，通過酒精燈上之火焰以徹底滅菌。 染色：將製備完成之玻片樣本置於染色架上，加上一滴染劑，在加上一滴水，以接種環於塗抹菌體於染色液中，靜置約3~5分鐘，使菌體上色。 可用另一張載玻片，輕放在染液上，將其染液拉開。 於無菌操作台內風乾。

9 乾燥：將玻片上多餘的水分輕輕甩乾，並利用濾紙將其吸乾，接著置於無菌操作台內使其自然風乾（此時不進行火烤加熱風乾，而以自然風乾為主）後備用。
鏡檢：先以低倍數光學顯微鏡找出菌體，然後再逐步換成高倍數接物鏡最終以油鏡進行菌體的觀察並繪圖記錄之。

10 實驗注意事項 進行細菌的染色時，樣本於玻片上之塗抹務求均勻，以免影響染色的效果。
進行陰性染色法時，染色前皆必須先確定玻片樣本呈現乾燥之狀態方可進行染色，否則易影響實驗之最終結果。 進行陰性染色法時，染劑固定步驟不宜以熱固定的方式進行，需以自然風乾的方法操作。

11 實驗結果 請畫出以陰性染色法觀察之菌體。 討論 比較不同菌種間的異同處