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仪器分析 曾 瑾 生命科学学院
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第四章 电泳技术
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电 泳 历 史 首次应用于生物学 首次称为电泳
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1809年，俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验。 显示了电渗透现象，为电泳理论和技术的发展奠定了基础。
+ - 电泳前 电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升
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Tiselius 和 移动界面电泳 移动界面电泳使解决生理学和 医学问题达到了一个新水平！ 获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、
α、β、γ球蛋白组成的。 移动界面电泳使解决生理学和 医学问题达到了一个新水平！ Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）
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电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。
例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。
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第一节 基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响：
第一节 基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响： ①颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，离解强度的难易等。 ②所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。 ③应用电场的性质，如：电场强度
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不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下：
μ=v/E=(d/t)/(U/I)=dI/Ut 式中:μ是迁移率，v是颗粒迁移速度(cm／s或cm/min)，E是电场强度或电势梯度(V／cm),d是颗粒移动距离(cm)，I是支持物的有效长度(cm)，U是支持物两端实际电压(V)，t是通电时间。
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一、带电颗粒的性质 1、电荷的来源： 胶体颗粒表面的电荷来源是： ①吸附液体中的某离子，因而带电，液体失去该离子而带相反的电荷。
②作为胶体组成成分的相反符号的离子不等量的进入溶液而带电。 ③固体表面吸附液体分子，然后这些分子解离，因而带电。
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2、电泳迁移率公式： 物质在电场中所受到的力(F)为： F=EQ (1)
根据史氏定律(Stoke's law)，球形分子在液体中泳动所受到的阻力(磨擦力)F`为： F`=6πrηυ (2) 式中r是分子半径，η是介质粘度，υ是分子泳动速度，6π是常数。
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当物质在电场中受到的力与物质在液体中受到阻力平衡时，F=F’
υ=EQ/6πrη (3) 已知迁移率(μ)为： μ=v/E μ=Q/6πrη
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二、电场强度 电场强度也称电位梯度，是指单位长度(每1 cm)支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。
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三、溶液的pH 溶液的pH决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。
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四、溶液的离子强度 在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要求最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快；通常缓冲液离子强度选择在0.05～0.1 mol／L之间。在缓冲液中离子强度可用下式计算： I=0.5∑cZ2 I=溶液的离子强度，c=离子的浓度，Z=离子的价数。
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五、电渗作用 在有支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对移动。
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综上所述，可知影响电泳迁移率的因子很多，可以分为以下三大类：
(a)与泳动离子(或粒子)本身的特性有关的因子，如电荷符号和大小、本身的大小和形状、水化程度、解离趋势、两性性质等。 (b)环境因素，如缓冲液浓度、离子强度、介电性质、化学性质、pH、温度、粘度、有无极性分子存在(因为它可以影响粘度或介电性)等。在有支持物的情况下，影响因素更多，如支持物的吸附作用，不均一性、离子交换能力、电渗现象、虹吸作用、热和蒸发作用等。 (c)所加电场的特性，如强度和纯度(是否杂有交流电)。这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。
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六、电泳的分类 （一）按分离的原理区分： 电泳按分离的原理可分为4种，即 区带电泳(zone EP，ZEP)、
移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、 等速电泳(isotachophoresis，ITP) 等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。
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1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出—个个互相分离的峰。（电泳分离原理图）
2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。 3、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。
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（二）按有无固体支持物区分 根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。 自由电泳又可分为：
①显微镜电泳(也称细胞电泳) ； ②移界电泳； ③柱电泳； ④自由流动幕电泳； ⑤等速电泳；
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按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类
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五十年代后，才开始固体介质电泳 凝胶电泳 使电泳技术得到了更快的发展
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总之，各种电泳技术具有以下特点： ①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析； ②样品用量极少； ③设备简单； ④可在常温进行； ⑤操作简便省时； ⑥分辨率高。
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第二节 常用的电泳技术 一、Tiselius移界电泳法 Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：
①能够形成清晰的起始界面； ②靠密度梯度能够稳定界面； ③能良好的散热； ④在泳动过程中可用光学方法显示其组分。
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1、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳 二、区带电泳 它具有简单快速等优点： ①电泳区带界限清晰； ②通电时间较短(20min至1 h)；
③对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象； ④不吸附染料，显示电泳区带背景干净。
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2、高压电泳 高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。（如图） 3、连续电泳 用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收集 （如图）
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4、凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖
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相关知识： ① 影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素、迁移速率由DNA的分子大小、琼脂糖浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等许多参数确定。 (不同琼脂糖对DNA的分离范围）
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琼脂糖凝胶电泳装置
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实验步骤 EB 90℃以上熔化，凝胶温度35-43 ℃ 制 胶
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1 2 3 1、孔深 、预留尺寸 3、梳子宽度 = 胶的厚度 3
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- + 加缓冲液
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拔梳子 最好在电泳槽中
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- + 点 样
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- + 紫外 电 泳
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﹣ ﹣ ﹢ ﹢
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DNA空间结构 电压 EB 电泳结果分析
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脉冲电场（PFGE） 解决大分子DNA电泳问题
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（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 （例）
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
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几个原理及名词： 凝胶原理 SDS作用与变性、非变性 连续与不连续
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样品缓冲液 缓冲液 凝胶缓冲液 电泳缓冲液 1xSDS : 50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8) 100 mmol/L DTT
10% 甘油 样品缓冲液 缓冲液 凝胶缓冲液 Tris 碱 用盐酸一次调PH成功 0.1% SDS 1xTris – 甘氨酸 : 25 mmol/L Tris 250 mmol/L 甘氨酸 (PH8.3) 0.1 % SDS 电泳缓冲液
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主要试剂及相关问题： 1、Acr 和 Bis 比例 29：1 ，此时分辨率最佳 ，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。 避光室温保存，隔几个月重配。神经毒！！！ 2、SDS 电泳级 10%母液，室温储备。 刺激呼吸系统！！ 3、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液 PH PH 8.8
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主要试剂及相关问题： 提供引发聚合反应的自由基。10% 4℃保存， 安全！ 4、TEMED (四甲基乙二胺)
通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低PH聚合反应受到抑制。 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！！！ 5、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。10% 4℃保存， 每周新配！！ 6、Tris-Gly Buffer 安全！
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凝胶浓度及其分离范围 丙烯酰胺浓度 线性分离范围/kDa 15 12 10 7.5 5.0 10-43 12-60 20-80 36-94
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SDS-PAGE 电泳装置
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实验步骤 安装玻璃板
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加水膜 灌注分离胶 约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体
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灌注浓缩胶 灌满！
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根据需要插入不同的梳子 30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！
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拔梳子后形成点样孔 孔周围有膜，用针拨开
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点样，电泳
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- +
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染 色 蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。
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染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤 脱色液配制：
50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤 脱色液配制： 10% 甲醇 10% 冰乙酸 80% 蒸馏水 5倍体积染色4小时以上， 脱色摇床，中间更换几次脱色液
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银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。
硝酸银染色 银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。 优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1ｎｇ)。 缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰
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硝酸银染色 化学显色 染色方法 光显色 是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-双胺络合物,将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化使其显色 双胺染色
是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用甲醛还原使其显色。 非双胺 染色 染色方法 是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性PH还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。 光显色
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聚丙烯酰胺凝胶的主要优点： ①分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2％(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开；（例） ②所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶； ③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。 ④可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。 ⑤丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。
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5、等电聚焦： 在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。
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_ - - - PI1 - - PI3 + - PI2 PH增加 + + + + + 蛋白质 1 2 3 + 蛋白质在电场中，等点聚焦示意图
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优点： ①分辨率很高； ②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。 ④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
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缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。
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6、毛细管电泳
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7、双向电泳 第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectric focusing,IEF)
第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
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染 色 蛋白质双向电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。
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2-DE Comparison of Proteins from two different conditions
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8、蛋白质印迹 蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应.
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Western blotting原理图示
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9、免疫电泳 1、抗原抗体特异性反应。 2、抗原在PH8.6时通常带强负电，而抗体不带电。
3、抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应，抗原过量，仅产生可溶性的免疫复合物与抗原一起向阳极移动。 4、抗原与抗体浓度达到当量点时，形成免疫沉淀带。
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免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP)是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。
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对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 双向免疫扩散与电泳相结合的技术。在pH8
对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 双向免疫扩散与电泳相结合的技术。在pH8.6的缓冲液中，抗原向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 (电渗使液体向负极泳动) 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。此法操作简便，仅需30～60分钟，灵敏度比双向扩散高10～15倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。
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火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis，RIEP)是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。
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双脱氧末端终止测序法的基本反应：GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA
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DNA序列分析法:双脱氧末端终止测序法
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凝 胶 聚丙烯酰胺 O CH CH2 NH2 C Acrylamide O CH CH2 NH C bis-Acrylamide
聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（ CH2 =CH-CO-NH2 ）和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺（ CH2 =CH-CO-NH-CO-CH=CH2 ） O CH CH2 NH2 C Acrylamide O CH CH2 NH C bis-Acrylamide Acrylamide
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自由基引发下而形成丙烯酰胺链的交联，从而形成了三维空间的凝胶网络
O CH CH2 NH2 C bis-Acrylamide NH 自由基引发下而形成丙烯酰胺链的交联，从而形成了三维空间的凝胶网络
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丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶具有一定的网状结构。如果形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状有关。
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SDS（C12H25NaO4S） H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+ H O 十二烷基磺酸钠
Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基磺酸钠 H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+ H O Non-polar Hydrophobic tail Hydrophilic head 是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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SDS and Proteins SDS Protein
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蛋白质分子与SDS充分结合后，所带上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。
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SDS-PAGE
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自然电泳与SDS变性电泳
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连续电泳 加 样 加电场，分子开始迁移 电泳结束 不连续电泳 加 样 加电场，样品浓缩在界面上 电泳结束
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