生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化.

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1 生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化

2 生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化 三个关键问题: 目标蛋白分子病理条件下的大小可能变化。
保护措施到位，避免目标蛋白分子的技术性降解（ -70C条件下保存， 实验操作通常在冰浴下进行，  充分使用蛋白酶抑制剂）。 选择合适的分离与纯化方案。

3 分离纯化目标蛋白分子的来源: 一个最基本的原则是方便大量得到。 牛、猪、马、兔和鼠等动物的肝脏或其他脏器组织。 患者的手术组织标本。 培养的人或其他哺乳动物细胞。 细菌或酵母菌。 基因克隆表达。

4 分离纯化目标蛋白分子的方法: 盐析法。 有机溶剂沉淀法。 等电点沉淀法。 吸附法。 结晶法。 电泳法。 超速离心法。 柱层析法。 ………………。

5 盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理: 蛋白质的溶解度，在低盐浓度范围随着盐浓度的升高而逐渐升高。此过程叫做盐溶(salting-in)。 当盐浓度达到一定程度后，再增加盐浓度，此时蛋白质的溶解度不是随着盐浓度的升高而升高，而是逐渐降低，在溶液中出现蛋白质沉淀析出。此过程叫做盐析(salting-out)。 不同蛋白质发生盐析时的盐浓度是不同的。这是蛋白质分子的一种特点。利用这一特点可对目标蛋白分子实施分离纯化。这种方法叫做盐析法。

6 等电点pH时，中性盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响 离子强度（） lg蛋白质溶解度
- 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 | | | | 等电点pH时，中性盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响 离子强度（） lg蛋白质溶解度 离子强度 （ionic strength）计算公式： ＝ C nZn2/2。 C：各种离子的摩尔浓度，Z：各种离子的所带电荷数。 0.5MK2SO4的离子强度＝(1 × × 22)/2=1.5。 1MNaCl的离子强度＝(1 × 12+1 × 12)/2=1。

7 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ＋ ＋ + + ＋ ＋ + ＋ ＋ ＋ + + + + ＋ ＋ +
O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H _ ＋ O H _ ＋ O H O H O H O H O H + _ + _ O H O H O H O H O H _ ＋ O H _ ＋ O H O H O H + _ O H O H O H O H O H O H _ ＋ O H O H O H O H O H O H O H O H O H _ ＋ O H _ ＋ O H + _ + _ O H O H + _ + _ _ ＋ O H _ ＋ O H + _ O H O H + _ O H O H 蛋白质分子 蛋白质盐溶过程示意图 正负盐离子

8 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ +
O H ＋ O H _ ＋ O H O H O H O H ＋ O H O H O H _ O H O H _ ＋ O H _ ＋ O H ＋ O H ＋ _ O H + _ + _ O H O H _ _ O H _ O H ＋ O H O H ＋ ＋ _ O H O H O H O H _ ＋ O H ＋ O H ＋ O H O H O H O H O H ＋ ＋ ＋ _ O H O H _ ＋ O H _ ＋ O H + _ + _ O H O H ＋ _ ＋ _ _ _ ＋ O H ＋ O H + _ + _ O H O H O H O H + _ + _ _ _ ＋ 蛋白质盐析过程示意图

9 蛋白质盐析实验用盐（中性盐）及其优缺点 盐 优点 缺点 硫酸铵 1）溶解度大，2）溶解度变化温度系数小，3）廉价易得，4）不易引起蛋白质变性，5）分段效果较好。 1）对蛋白氮的测定有干扰，2）缓冲能力较差。 硫酸钠 1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得，3）盐析免疫球蛋白效果不错。 1）30C一下溶解度低， 2）溶解度变化温度系数大。 磷酸钠 1）效果有时优于硫酸铵，2）对蛋白氮的测定无干扰，3）廉价易得。 1）溶解度低，2）溶解度变化温度系数大。 氯化钠 1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得。 1）溶解度较低，2）溶解度变化温度系数大。 硫酸镁

10 蛋白质盐析实验需要注意的几个问题 盐的使用浓度：不同蛋白质的盐析所要求的盐浓度不同。分离混合组分蛋白质时，盐的浓度由低到高渐次增大。每出现一种蛋白质的沉淀时，则进行离心或过滤，分离所沉淀蛋白质，再继续增加盐的浓度，使第二种蛋白质沉淀。一个例子：用盐析分离血浆中蛋白质，1)硫酸铵浓度20％时纤维蛋白原析出；2)硫酸铵浓度28％33％时，优球蛋白析出；3)硫酸铵浓度33％50％时，拟球蛋白析出；4)硫酸铵浓度50％以上时，白蛋白析出。

11 蛋白质盐析实验需要注意的几个问题 pH值：通常选择目标蛋白的等电点。 蛋白质浓度：在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越容易沉淀析出，但蛋白质浓度过大容易引起其他杂蛋白的共沉淀析出。 温度：浓盐对蛋白质有一定的保护作用，因此蛋白质盐析操作通常在室温下进行。至于那些对热敏感的酶，则宜维持在低温4C条件下进行盐析。 脱盐：透析法。

12 透析缸 透析液（蒸馏水或缓冲液，加入防腐剂） 透析袋（半透膜） 蛋白质溶液 蛋白质透析脱盐，4C下

13 半透膜 蛋白质溶液 离心管 支持栅板 蛋白质超过滤脱盐，4C或0C下

14 柱层析法 (Column chromatographic method)
离子交换柱层析（Ion-exchange column chromatography） 分子筛柱层析（Molecular sieve column chromatography） 反向柱层析（Reverse-phase column chromatography） 疏水柱层析（Hydrophobic interaction column chromatography） 亲和柱层析（Affinity column chromatography）

15 分子筛柱层析（Molecular sieve column chromatography)
凝胶过滤层析（Gel filtration column chromatography) 凝胶渗透层析（Gel permeation column chromatography) 小分子 大分子 凝胶颗粒 装载小分子的凝胶颗粒

16 Affinity chromatography
Other proteins Target proteins 2 1 3 Agarose Ligand 4 5 +

17 DNA affinity chromatography-1
1 Sepharose 4B-dsDNA ACGT………… ………… ………… …………TGCA 2 Target proteins ACGT………… ………… ………… …………TGCA ACGT………… ………… 3 Other proteins

18 DNA affinity chromatography-2
1 Sepharose 4B-ssDNA ACGT………… …………TGCA …TGCA ACGT………… …………TGCA …TGCA ACGT………… …………TGCA 2 dsDNA ACGT………… …………TGCA ACGT… ACGT………… …………TGCA …TGCA ACGT… ACGT… 3 Target proteins 4 Other proteins