第十三章 细胞衰老和死亡 cellular aging and cell death

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1 第十三章 细胞衰老和死亡 cellular aging and cell death
山东大学医学院细胞生物学研究所 山东大学医学院细胞生物学研究所

2 第一节 细胞衰老 1. 什么是细胞衰老？ 细胞衰老是一个不可逆的过程。 （Cellular aging）
细胞衰老（cell senescence or aging）——指细胞在正常条件下发生的细胞的生理功能和增殖能力减弱，以及细胞形态发生改变，并趋向死亡的现象。 细胞衰老是一个不可逆的过程。 山东大学医学院细胞生物学研究所

3 2. 什么是机体衰老？ 机体衰老是指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多因素控制的不可逆的生物学现象，机体的衰老与动物的寿命密切相关。 山东大学医学院细胞生物学研究所

4 3. 细胞衰老与机体衰老的关系 个别细胞或局部许多细胞的衰老并不 影响机体的寿命 机体衰老并不代表所有细胞的衰老
个体的衰老是建立在总体细胞衰老的基础上 细胞总体的衰老反应了机体的衰老 山东大学医学院细胞生物学研究所

5 4. 机体内各类细胞的寿命不同 （1）长寿命细胞 （细胞寿命接近整体寿命） 神经元，脂肪细胞，肌细胞 （2）缓慢更新的细胞 肝细胞，胃壁细胞
（3）快速更新且寿命较短的细胞 皮肤的表皮细胞，红细胞和白细胞 山东大学医学院细胞生物学研究所

6 5. 体外培养的细胞寿命取决于多种因素 实验证明，体外培养的细胞寿命取决于 1）体外可传代的次数 2）来源个体的年龄 3）物种的寿命 这些规律是由Hayflick研究和发现的， 故称为 Hayflick界限。 山东大学医学院细胞生物学研究所

7 不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数 实验证明: 细胞增殖能力与供体年龄有关; 体外培养细胞倍增次数与原个体年龄成反比关系. 细胞来源
人胚肺成纤维细胞 中年人成 纤维细胞 老年人成 可增殖代数 40-60 20 2-4 实验证明: 细胞增殖能力与供体年龄有关; 体外培养细胞倍增次数与原个体年龄成反比关系.

8 物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系
不同物种的细胞最大分裂次数与动物平均寿命成正比

9 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 + 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境; 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老
老年男性体细胞 培养 混合培养 年轻女性体细胞 培养 结果: 混合培养中各自的倍增次数与单独培养一样 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老 年青胞质体 老年细胞 不能分裂 年青细胞 + 分裂能力与年青细胞一样 Cytochalasin处理细胞 得到胞质体 离心 老年胞质体

10 6. 细胞衰老有什么表现？ （1）细胞衰老的形态结构改变 山东大学医学院细胞生物学研究所

11 6. 细胞衰老有什么表现？ （2）细胞衰老过程中有生物大分子的改变 ①DNA：复制与转录受阻，端粒DNA、mtDNA丢失。
②RNA：mRNA含量和与核糖体结合力降低。 ③蛋白质：含成速度下降，发生修饰、交联、稳定性 下降、功能降低。 ④酶分子：活性中心被氧化，金属离子丢失，酶分子 的二级结构，溶解度，等电点发生改变，酶失活。 ⑤脂类：不饱和脂肪酸被氧化。 山东大学医学院细胞生物学研究所

12 衰老症状与原因分析 皮肤干燥、发皱 细胞水分减少，体积减小 头发变白 细胞内的酶活性降低 老人斑 细胞内色素的累积 饮食减少
细胞膜通透性功能改变 山东大学医学院细胞生物学研究所

13 7. 细胞为什么发生衰老？ （1）遗传决定学说认为衰老是遗传的程序化过程 患有早衰症的六岁女童 山东大学医学院细胞生物学研究所

14 7. 细胞为什么发生衰老？ （1）遗传决定学说认为衰老是遗传的程序化过程 子女的寿命与双亲的寿命有关；
各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命； 早衰症患者体内解旋酶发生突变。 SGS1基因和WRN基因同源, 编码解旋酶，与衰老有关； 如：酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型。 WRN基因突变：引发早老症。 ④ Caenrhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1 单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。 山东大学医学院细胞生物学研究所

15 7. 细胞为什么发生衰老？ （2）自由基学说认为活性氧基团导致细胞损伤和衰老
自由基是原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团。是一类高度活化的分子，对细胞或组织产生十分有害的生物效应。 内源性自由基： 体内各种代谢产物产生的，是自由基的主要来源 外源性自由基 受高温，辐射，光解，化学物质等引起的外源性自由基 山东大学医学院细胞生物学研究所

16 自由基对细胞的损伤 胞内蛋白（酶类）氧化受损，交联、变性失活，细胞功能退化而导致衰老；
不饱和脂肪酸氧化为过氧化脂质，影响膜内酶活性和蛋白质变性，膜结构改变； DNA链断裂、交联、碱基羟基化而损伤； 自由基数量随年龄增多，导致各器官细胞脂褐质与蜡样物质增多。 山东大学医学院细胞生物学研究所

17 7. 细胞为什么发生衰老？ （3）端粒钟学说认为端粒缩短会导致为细胞衰老 端粒是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复系列组成。
端粒随细胞的分裂不断缩短， 当端粒长度缩短到一定阈值时，细胞就进入衰老过程。 山东大学医学院细胞生物学研究所

18 7. 细胞为什么发生衰老？ （4）细胞代谢废物累积可引起细胞衰老
当细胞功能下降，细胞既不能将代谢废物及时排出胞外，又不能将其降解与消化，积累的代谢废物会影响细胞的正常生理功能，从而引起细胞的衰老。 山东大学医学院细胞生物学研究所

19 7. 细胞为什么发生衰老？ （5）基因转录或翻译差错导致细胞衰老 随着年龄的增长， 细胞内的DNA复制效率下降，
核酸，蛋白质，酶等大分子的合成差错， 最终引起细胞功能降低，导致细胞衰老。 山东大学医学院细胞生物学研究所

20 第二节 细胞死亡 1. 什么是细胞死亡？ (Cell Death）
细胞坏死是指在外来致病因子的作用下，细胞生 命活动被强行终止所致的病理性、被动性的死亡 过程。 细胞凋亡是指在特定信号诱导下，细胞内的死亡 级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的 死亡过程。 山东大学医学院细胞生物学研究所

21 2. 细胞死亡的原因 外界原因 内在因素 剧烈，引起细胞坏死（necrosis) 相对不剧烈 细胞凋亡 山东大学医学院细胞生物学研究所

22 3. 细胞死亡的特征与形式 细胞坏死：细胞膜与胞浆中的细胞器的质膜发生破裂，细胞浆外溢，细胞解体并引起周围组织发生炎症反应。
细胞凋亡：胞膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成一些囊状小体，即凋亡小体（apoptotic body),后者被周围吞噬细胞吞噬，不引起炎症。 山东大学医学院细胞生物学研究所

23 细胞坏死和细胞凋亡

24 坏死细胞 凋亡细胞

25 4. 细胞死亡的另一种形式——自噬 细胞自噬（autophagy): 真核生物细胞通过降解细胞内长寿命蛋白和细胞器，产生氨基酸以维持细胞在缺乏营养时的生存。 特征：形成双层膜的自噬泡，自噬泡可包裹细胞质、大型细胞器，然后与溶酶体结合，并分解内容物，供细胞使用。 意义：是细胞在不良的情况下的一种应急的反应。 自噬被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统 山东大学医学院细胞生物学研究所

26 酵母自噬相关基因Atg ( Autophagy related gene) ，它们的编码蛋白在自噬的诱导、产生、成熟、再循环中起重要作用。

27 第三节 细胞凋亡 1. 什么是细胞凋亡？ (Apoptosis)
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。 又称程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD), 即在一定时间内，细胞按一定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。 山东大学医学院细胞生物学研究所

28 细胞凋亡的典型例子 发育中神经细胞的凋亡 哺乳动物的手指和脚趾 由连在一块到逐个分开的 伴随细胞凋亡 幼体蝌蚪向成体发育过程中
尾部细胞发生凋亡后脱落

29 2. 细胞凋亡的特征 山东大学医学院细胞生物学研究所

30 细胞凋亡时的形态学改变 细胞核：核DNA聚集，浓缩成染色质块， 细胞核呈帽状或新月形，染色质进一步聚集使核膜断裂， 并形成核碎片或核残片。
细胞核呈帽状或新月形，染色质进一步聚集使核膜断裂， 并形成核碎片或核残片。 2.细胞质：细胞质密度增加，胞浆浓缩。线粒体先增 大，而后空泡化；内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜 融合；细胞骨架致密并紊乱。 3.细胞膜：微绒毛，细胞突起，细胞间连接复合体普 遍消失。此时，细胞膜结构仍保持完整。 4.凋亡小体的形成： 细胞核的碎片形成后会不断转化为大小不等，内含胞质，细胞器以及核碎片的膜包小体，即凋亡小体。

31 不同细胞凋亡时的形态学改变

32 细胞凋亡时的生化改变 DNA 片段化（fragmentation)
DNA电泳呈现出梯状条带（DNA ladders），内源性核酸内切酶活化（依赖 Ca2+/Mg2+ ，Zn2+是其抑制剂）

33 细胞凋亡时的生化改变 2. 细胞凋亡中的蛋白酶 控制凋亡的蛋白酶有多种，如胱天蛋白酶（cystein aspartic acid specific protease, Caspase) ，钙蛋白酶。这些酶在凋亡过程中发挥关键的调控作用。 3.胞浆Ca2+ 、pH的变化 Ca2+ Ca2+库开放，胞内Ca2+浓度升高，可作为凋亡启动的信号。 Ca2+的释放会破坏细胞的稳定结构，从而也会触发细胞凋亡。 细胞凋亡时，胞浆内的pH先急性升高，后又缓慢降低。

34 细胞凋亡时的生化改变 4. 线粒体在细胞凋亡中的生化变化 1）线粒体呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡。
2）线粒体释放细胞色素C（cytochrome C, cytC) 而cytC是凋亡所必需的胱天蛋白酶(caspase)家族激活物。 3）线粒体是细胞产生活性氧类物质（reactive oxygen species, ROS)的主要来源，ROS是细胞凋亡的信使分子和效应分子，凋亡时，线粒体生成ROS增多。 4）线粒体渗透转变孔（permeability transition pore, PT pore）通透性增高，这是凋亡早期的决定性变化。PT孔是线粒体内膜和外膜在接触部位协同组成的一条通道，PT孔的开放可导致线粒体呼吸链解偶联，并且线粒体内的cyt C可通过开放PT孔释放到胞质，进而触发caspase 级联反应。

35 细胞凋亡时的线粒体释放细胞色素C

36 2. 细胞凋亡的另一种形式——失巢凋亡 失巢凋亡（anoikis)是因细胞与细胞外基质和其它 细胞脱离接触而诱发的。

37 3. 细胞凋亡是受哪些因素调控的？ （1）细胞凋亡的诱发因素 ①生理性诱导因子: TNF , FasL, TGF-β，神经递质、 Ca2+, 糖皮质激素等。 ②损伤相关因子: 热休克，病毒感染，原癌基因、 抑癌基因、 细胞毒性T细胞，氧化剂、自由基。 缺血、缺氧等。 ③疾病治疗相关因子: 化疗， 放疗，等 ④其它某些细胞毒性物质: 如乙醇、等。 山东大学医学院细胞生物学研究所

38 3. 细胞凋亡是受哪些因素调控的？ （2）细胞凋亡的抑制因素 ①生理性抑制因子: 如bcl-2 原癌基因，突变型p53,各种生长因子，细胞外基质。 ②病毒基因: 如腺病毒E1B 等 ③其它: 线虫的ced-9 基因，caspase 抑制剂，促癌剂（如PMA）。 山东大学医学院细胞生物学研究所

39 4. 细胞为什么会发生凋亡？ 细胞凋亡的调控主要受多种基因调控 （1）调控细胞凋亡的Ced基因家族 Ced 基因是线虫的细胞凋亡关键调控基因。 Ced3 、ced4的可促进细胞的凋亡。 Ced9基因可抑制细胞凋亡的发生 与Ced基因家族同源的哺乳动物基因 Caspase 3与Ced3同源 Apa-f1与Ced4同源 Bcl-2基因与Ced9同源 山东大学医学院细胞生物学研究所

40 Regulation of Ced Proteins for Cell Apoptosis
Ced-3 和 Ced-4分子发挥活性，诱导细胞发生凋亡。

41 哺乳动物 参与细胞凋亡的Caspase基因
Caspase-2,caspase-8,caspase-9, caspase-10 参与凋亡起始 Caspase-3,caspase-6, caspase-7 参与凋亡执行， 它们能降解多种底物， 导致核纤层和细胞骨架的断裂崩解。

42 (2) 既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2基因家族
bcl-2基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,bcl2）的 缩写，又称“存活基因（survival gene)” 。 同家族的Bad，Bax 是凋亡的促进者。

43 Molecular Structure of Bcl-2 Protein Family

44

45 （3） 可促进细胞凋亡的ice基因 （4） 参与调节细胞凋亡的p53基因 p53为抑癌基因，其蛋白在人类存在两种形式。
ICE基因（interleukin-1 β converting enzyme, ICE) 与线虫的ced-3基因在DNA序列上高度同源。其作用是将IL-1β前体分解为有生理活性的白细胞介素-1β。 ICE过度表达可诱导哺乳动物纤维母细胞发生凋亡。 （4） 参与调节细胞凋亡的p53基因 p53为抑癌基因，其蛋白在人类存在两种形式。 野生型：促进细胞凋亡 突变型: 抑制细胞凋亡

46 (5) 可触发细胞凋亡的Fas 和FasL Fas 属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,
TNFR)和神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR） 超家族的细胞表面分子； Fas配体（Fas ligand, FasL)是TNF家族的细胞表面分子。 多种哺乳动物细胞表达Fas；FasL只在活化的T细胞表达 Fas需要通过和FasL结合后发挥调控作用 。

47 Molecular Structure of Fas
配体FasL与死亡受体Fas结合后，诱导Fas胞质区内的死亡结构域（DD） 结合Fas结合蛋白（FADD），FADD再结合Caspase-8前体，形成 Fas—FADD—Caspase-8前体组成的死亡诱导复合物，进一步诱导细胞凋亡。

48 （6） c-myc 基因既是凋亡的激活因子又是抑制因素 表达蛋白：c-Myc-1, c-Myc-2
Myc与Max形成二聚体作为转录调节因子，激活 介导细胞增殖的基因和诱导凋亡的基因。 细胞在C-Myc基因作用下出现哪种结果，取决于 细胞接受的外来信号。

49 5. 细胞凋亡的信号转导通路是由什么调控的？ 细胞凋亡的信号调控主要由 死亡受体和线粒体两种通路参与调控。 （1）死亡受体介导的信号转导通路
死亡受体主要属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族,主要有成员有Fas/Apo-1/CD95, DR-4/TRAIL-R1, DR3/WSL-1/Apo-3/TRAMP。 细胞外很多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体结合，激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。 （2）线粒体介导的信号转导通路 许多凋亡信号都可引起线粒体的损伤和膜通透性改变。有线粒体释放的Cyt.C进入胞浆可以与Apaf-1一起与Caspase-9的前体结合，并进一步激活Caspase-3,引起细胞凋亡。 山东大学医学院细胞生物学研究所

50 哺乳动物细胞凋亡的主要信号转导通路 山东大学医学院细胞生物学研究所

51 6. 如何检测细胞凋亡？ (1）形态学检测 染色法、透射和扫描电镜观察 核固缩，核成新月状、花瓣样，凋亡小体 山东大学医学院细胞生物学研究所

52 （2）生化特征检测 TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法； 彗星电泳法（comet assay）；
DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带（DNA ladders）； TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法； 彗星电泳法（comet assay）； 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 线粒体膜势能的检测 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker 特点： 多为DNA单链断裂，大多位于核小体间的连接部位，多为200bp的倍数 山东大学医学院细胞生物学研究所

53 （3）流式细胞仪检测—即可定性又可定量 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。 凋亡细胞在正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰（Apoptotic Peak, AP） 山东大学医学院细胞生物学研究所

54 6. 细胞凋亡异常会引起哪些疾病？ （1）细胞凋亡过低引起的相关疾病 ① 肿瘤
① 肿瘤 凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达，或促凋亡基因如p53基因突变或缺失，细胞凋亡不足，导致肿瘤发生。 ② 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE) 由于Fas表达缺陷，引起自身反应性T细胞的凋亡功能丧失，导致T淋巴细胞凋亡障碍，因此，在外周淋巴器官出现大量CD4+, CD8+的T淋巴细胞，这些细胞具有自身反应性，从而引起SLE自身免疫性疾病 山东大学医学院细胞生物学研究所

55 6. 细胞凋亡异常会引起哪些疾病？ （2） 细胞凋亡过度引起的相关疾病 ① 神经元退行性疾病 ———特定神经元进行性丧失为特征的疾病
① 神经元退行性疾病 ———特定神经元进行性丧失为特征的疾病 阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD）主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见β-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结. ② AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致 CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。 ③心血管疾病 心力衰竭、 心肌缺血与再灌注损伤 ——— 坏死与凋亡共存 凋亡特点： a.早期凋亡为主，晚期坏死为主 b.梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 山东大学医学院细胞生物学研究所