实验一 总结 第一、要求； 实验现象和现象产生的原因需要对应写； 实验中遇到的问题和处理方法对应着写； 第二、希望； 希望能够多提出问题；

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1 实验一 总结 第一、要求； 实验现象和现象产生的原因需要对应写； 实验中遇到的问题和处理方法对应着写； 第二、希望； 希望能够多提出问题；
实验一 总结 第一、要求； 实验现象和现象产生的原因需要对应写； 实验中遇到的问题和处理方法对应着写； 第二、希望； 希望能够多提出问题； 每周二的理论课中进行讨论，希望大家积极思考。

2 组织总RNA抽提

3 一、RNA简介 A-U G-C RNA 腺嘌呤（A） 尿嘧啶（U） 胞嘧啶（C） 鸟嘌呤（G） 四种核苷酸串联组成的单链。 DNA
胸腺嘧啶(T) A-U G-C

4 信使RNA（mRNA） 转录DNA上的遗传信息
核糖体RNA（rRNA） 与蛋白质结合形成核糖体，形成细胞内蛋白质合成的场所 转运RNA（tRNA） 运输被激活的氨基酸，翻译mRNA上的氨基酸序列 真核细胞中还存在 不均一RNA (hnRNA) 小核RNA (snRNA) 小RNA (microRNA) 非编码RNA (ncRNA)

5 rRNA(80-85%)5S,5.8S,18S,28S（主要提的是rRNA）
120,160, 1874,4718个核苷酸组成 tRNA(15-20%) 70~90个核苷酸组成 mRNA(1-5%) kb

6 tRNA

7 控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。
mRNA与蛋白质的表达具有关联性。 控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。 研究发现，所有基因均先转录成mRNA，再翻译成蛋白质。 生物遗传中心法则

8 细胞内RNA转录过程

9 RNA酶广泛存在而稳定，反应一般不需要辅助因子； 耐受多种处理（如煮沸、高压灭菌等 ）而不被灭活。
内源性：核内 外源性：外界

10 常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制强烈 异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物 有效抑制
异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物 有效抑制 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制 其它：SDS、尿素、硅藻土等 有效抑制 上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！

11 3. 取材 动物新鲜组织、细胞 -80C冷冻组织 液氮冷冻组织（-196 ℃） RNA 储存液保存 其它

12 二、与RNA有关的研究方法 RT-PCR RNA序列分析 Northern 杂交 RNA干扰技术（RNAi）
mRNA通过RT-PCR（逆转录-PCR），可建立相应cDNA文库 RNA序列分析 潜在基因分析 Northern 杂交 用于真核细胞中RNA表达和大小的检测分析（RNA-DNA探针） RNA干扰技术（RNAi） 通过双链小干扰RNA（siRNA）的形成，诱导同源mRNA降解

13 三、组织RNA的抽提和纯化 RNA质量的标准 完整性 — 避免外源性及内源性RNase对RNA的降解
均一性 — 有效去除抽提过程中残留的DNA、蛋白质和有机溶剂

14 组织RNA抽提纯化方法 TRIzol试剂抽提法 利用含异硫氰酸胍成分的TRIzol破碎组织细胞，并抑制细胞释放的核酸酶。 硅胶膜纯化柱抽提法
硅胶膜纯化柱能迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇等沉淀，只须不断洗脱即可得到高纯度的RNA。

15 实验的主要操作步骤 组织（50mg）+ Trizol（1ml），制成匀浆，冰浴10分钟 加入氯仿（200μl），颠倒（震荡）混匀，静置片刻
START 高速离心 12000rpm 4℃ 15min 取上清液，加入等体积异丙醇（4 ℃），混匀，沉淀5 分钟 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 弃上清液，加入1 ml的75%乙醇-DEPC H2O洗涤一次 离心12000rpm，5min 弃上清液，37 ℃干燥后，加入50 ul的DEPC-H2O溶解（55 ℃水浴，10分钟），定量测定，-80 ℃保存

16 TRIzol试剂 常用总RNA抽提试剂 组织+ Trizol，制成匀浆 组织应先用生理盐水冲洗，去除残留的血液，用剪刀等切成小块
苯酚：裂解细胞，有效变性蛋白质。 异硫氰酸胍： 解偶剂，强力蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。同时，异硫氰酸胍也是常用RNA抑制剂，可使RNase失活。 8 -羟基喹啉：抑制RNase。 β-巯基乙醇：破坏RNase蛋白质中的二硫键。

17 氯仿 加入氯仿（200μl），颠倒混匀，静置片刻 学名：三氯甲烷 英文名：Chloroform 作用： ① 蛋白变性剂
② 溶解、去除前一步操作中残留的苯酚

18

19 离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。
高速离心 12000rpm 4℃ 10min 离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。 ** 在除去水样层后，亦可用沉淀法来逐步分离样品中的DNA和蛋白质。如：乙醇沉淀中间层的DNA；在有机层中加入异丙醇，沉淀蛋白。

20 水相 中间层

21 异丙醇 取上清液，加入等体积异丙醇，静置 俗称IPA，是正丙醇（CH3CH2CH2OH）的同分异构体。
在抽提过程中进一步溶解样本中的蛋白质，沉淀RNA，起到纯化作用。 静置主要为了提高沉淀效率。 ** 吸取上清液时，尽量不要混入任何中间层 物质，否则会出现染色体DNA污染。

22 再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。
高速离心 12000rpm 4℃ 10min 离心前RNA沉淀通常不可见。 再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。 上清液中为异丙醇、残余蛋白质。所以尽可能去除上清液。 上清液 RNA

23 主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。
加入75%乙醇-DEPC H2O 主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。 DEPC-H2O DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

24 弃上清液，自然干燥后，加入DEPC-H2O溶解，定量测定
离心 12000rpm 3min 弃上清液，自然干燥后，加入DEPC-H2O溶解，定量测定 通过离心，RNA再次沉淀。弃去洗涤液（乙醇-DEPC H2O ），并利用乙醇挥发性，去除残留的有机试剂。避免外源性RNase污染，自然干燥。 ** 最后定量测定时，先将溶解的RNA原液吸取1μl至新EP管，加入99μl DEPC H2O进行稀释。

25 RNA纯度 A260nm RNA含量 A280nm 1.8-2.0， 表明样本纯度相对较高
RNA(μg/ml ) = A260nm×40×1/光径×稀释倍数 光径 – 测定时分光光度计的参数。 40 – 在单位条件下，RNA在260nm波长下吸光度为1时，浓度为每毫升40μg。 稀释倍数 – 直接检测时，稀释倍数为1；常用的稀释倍数为1：50、1：100等。

26 实验的主要操作步骤 提取部分 纯化部分 组织 + Trizol ，制成匀浆 加入氯仿, 颠倒混匀，静置片刻
高速离心 12000rpm 4℃ 10min 取上清液，加入异丙醇，静置 纯化部分 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 弃上清液，加入75%乙醇-DEPC H2O 离心 12000rpm 3min 弃上清液，自然干燥 加入DEPC-H2O溶解， 1:100稀释定量测定

27 注意事项 样本选择 * 血液样本，应为新鲜血液，不得超过4小时的放置。如需过后处理，应先加入TRIzol试剂，置于-80℃保存。
** 组织样本，应取动植物生长旺盛的部分，如：动物的肝组织，植物的幼芽。 *** 细胞样本，应选择处于生长旺盛期的细胞。

28 注意事项 DEPC是RNase的化学修饰剂，可与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。所以DEPC是活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。 DEPC能与腺嘌呤作用，从而破坏mRNA活性。 配制含DEPC成分的试剂时，应在加入DEPC后剧烈振荡10min，再高压灭菌以消除残存的DEPC。 DEPC能与胺、巯基反应，故含Tris及DTT的试剂不可加入DEPC。

29 注意事项 RNase污染的主要来源 实验操作者手指、唾液 Tip 头 水/缓冲液 阳离子（Ca+、Mg2+） 其他实验（eg:质粒抽提）影响
后续实验所用酶 ……

30 注意事项 杜绝RNase污染 （1）避免外源性RNase的污染 （2）消除内源性RNase * 实验中佩戴口罩和手套；
** 涉及的实验器具设备应彻底处理； *** 试剂及使用的溶液必须为RNase-Free，其中，水必须处理，多用0.1%DEPC-H2O。 （2）消除内源性RNase 选择合适的匀浆方法和裂解液，合理控制样本量。

31 常见问题分析 提取RNA量较少 ► 样本裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放出来 ► 定量检测时RNA沉淀未完全溶解

32 常见问题分析 RNA样品的A260/A280值小于1.6 ► 检测吸光度时，RNA应用DEPC-H2O溶解，不用TE。低离子浓度和低pH条件下，A280值会偏高。 ► 制备匀浆时，Trizol试剂量过少。 ► 匀浆液未室温静置5min，RNA未与核蛋白完全分离。 ► 吸入有机相，带入蛋白质和DNA的污染。 ► 检测吸光度时，RNA沉淀未完全溶解。

33 分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 思考： 如何从总RNA中分离mRNA?

34 THE END THANK YOU