生化实验方法与技术总复习.

Presentation on theme: "生化实验方法与技术总复习."— Presentation transcript:

1 生化实验方法与技术总复习

2 第一章 基本实验技术 一、缓冲溶液：一类能够抵制外界加入少量酸和 碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。
第一章 基本实验技术 一、缓冲溶液：一类能够抵制外界加入少量酸和 碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。 二、测定溶液pH值通常有两种方法： pH试纸、 pH计。pH试纸分为广泛和精密pH试纸两种。

3 第二章 生物大分子的制备 一、与化学产品的分离制备相比较而言，生物大分子的制备有哪些特点？
第二章 生物大分子的制备 一、与化学产品的分离制备相比较而言，生物大分子的制备有哪些特点？ 1、生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 2、许多生物大分子在生物材料中的含量极微。 3、 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活。 4、生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的。

4 二、要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有哪些？
（1）在水和各种有机溶剂中的溶解性。 （2）在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 （3）固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 （4）各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。 （5）其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 （6）对其他生物分子的特殊亲和力等。

5 四、盐溶和盐析的定义 三、影响生物大分子的提取的主要因素有哪些？ （1）目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； （2）由固相扩散到液相的难易；
（3）溶剂的pH值和提取时间等。 四、盐溶和盐析的定义

6 五、生物大分子分离纯化的方法有哪些？各自的定义及原理。
1、沉淀法：溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 基本原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而分离。 2、透析法：在生物大分子的制备过程中，利用透析膜的扩散压除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等的实验方法。 基本原理：半透膜两边的扩散压。 3、超滤法：在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。 4、冰冻干燥法：先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的实验方法。 基本原理：固、液、气三相的相互转化机理。

7 六、沉淀法中的中性盐沉淀法最为常用，中性盐沉淀法中又以硫酸铵最为常用，为什么？
1、溶解度大； 2、分离效果好； 3、 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用； 4、 价格便宜； 5、废液不污染环境。

8 七、影响生物大分子样品保存的主要因素有哪些？
1、空气 2、温度 3、水份 4、光线 5、样品的pH 6、时间

9 八、各分离纯化方法之间的比较。如何分离纯化生物大 分子物质（是否可以举例说明）。
主要掌握有机溶剂沉淀法、选择性变性沉淀法、离子交 换层析法、凝胶过滤层析法、分配层析法、亲和层析 法、超滤等方法之间的比较。 如何分离可以从早期和晚期分离纯化方法的选择上进行 发挥。

10 第三章 层析技术 一、层析当中所涉及到的一些基本概念。（固定相，流动相， 分配系数，相对迁移率，正相色谱，反相色谱，操作容量）
第三章 层析技术 一、层析当中所涉及到的一些基本概念。（固定相，流动相， 分配系数，相对迁移率，正相色谱，反相色谱，操作容量） 固定相：层析的基质。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体或超临界体等。 分配系数：在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含 量（浓度）的比值。 相对迁移率：在一定条件下，相同时间内，某一组分在固定相 中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离的比值。

11 正相色谱：固定相的极性高于流动相的极性的层析技术。
反相色谱：固定相的极性低于流动相的极性的层析技术。 操作容量（或交换容量）：在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。

12 二、层析法的分类。各类层析的定义及原理。
三、柱层析的基本操作步骤。 四、凝胶层析基质的种类及所涉及的一些概念（外水体 积，内水体积，基质体积，柱床体积，洗脱体积，排阻 极限，吸水率，床体积。）

13 五、凝胶的保存。 六、凝胶层析柱的鉴定。 七、离子交换层析的分类，以电荷基团和平衡离子分类的话是 否相同。 八、离子交换剂的种类及离子交换剂的再生。平衡缓冲液。洗 脱液的选择。 阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，这种离子交换剂称为阳离子交换剂。 平衡缓冲液：装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。

14 洗脱液的选择： （1）首先要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。 （2）其次，使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。 （3）另外，使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。

15 九、亲和层析配体的分类及定义。亲和吸附剂的再生和保存。
特异性配体：只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。 通用性配体：特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。 亲和吸附剂的再生：使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法去除吸附在基质和配体（主要是配体）上的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力的过程。 亲和吸附剂的保存： 一般是加入0.01%的叠氮化钠，4℃下保存。 也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。

16 第四章 电泳技术 一、电泳装置包括两个部分：电源和电泳槽。 二、电渗现象及其对电泳的影响。
第四章 电泳技术 一、电泳装置包括两个部分：电源和电泳槽。 二、电渗现象及其对电泳的影响。 电渗现象：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动。 如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。

17 四、 SDS、 -巯基乙醇、溴酚蓝、蔗糖及甘油的作用
三、电泳的分类。 四、 SDS、 -巯基乙醇、溴酚蓝、蔗糖及甘油的作用 1、它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。 （2）强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。 （3）样品处理液中通常需加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。 （4）样品处理液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液容易沉入样品凹槽底部。

18 五、蛋白质印迹的定义及基本操作步骤。 Western印迹法：对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析。 2、基本操作步骤
（1）首先是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。 通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 （2）转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。 （3）印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点。 （4）而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理。印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。这样，清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。 （5）处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理。二抗是指一抗的抗体。如一抗是从鼠中获得的，则二抗是抗鼠Ig G的抗体。 （6）处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

19 第五章 离心技术 一、制备性超速离心机的主要分离方法。 1、差速沉降离心法 2、密度梯度区带离心法 （1）差速区带离心法
第五章 离心技术 一、制备性超速离心机的主要分离方法。 1、差速沉降离心法 2、密度梯度区带离心法 （1）差速区带离心法 （2）等密度区带离心法 二、制备性离心机的主要类型 1、普通离心机 2、高速冷冻离心机 3、超速离心机

20 第六章 分光光度技术 一、分光光度计的基本组成 1、光源 2、单色器 3、样品室 4、检测放大系统 5、显示器

21 第七章 免疫化学技术 一、抗原和抗体的定义及分类 抗原（antigen,Ag）：进入异种机体后，能致敏淋巴细胞、能与抗体发生特异结合的物质。
第七章 免疫化学技术 一、抗原和抗体的定义及分类 抗原（antigen,Ag）：进入异种机体后，能致敏淋巴细胞、能与抗体发生特异结合的物质。 （1）根据抗原物质所具备的性能：完全抗原（complete antigen）；半抗原（hapten）。 （2）根据抗原的来源：外源性抗原；内源性抗原。 （3）根据抗原的化学组成：蛋白质、糖类、脂类与核酸等抗原。 抗体：机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 目前已发现的人免疫球蛋白有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。

22 二、抗原和抗体之间靠什么力结合在一起的？
抗原与抗体是通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力、静电引力、氢键、疏水性作用等。 三、免疫佐剂的定义及分类。 免疫佐剂（immunoadjuvant）（简称佐剂）：先于抗原 或与抗原一起注入人体，可增强机体对该抗原的特异性 免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 （1）无机佐剂； （2）有机佐剂； （3）合成佐剂； （4）油剂。