應用重組酵母菌報導基因試驗法評估台灣河川中類雌激素物質之分佈

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1 應用重組酵母菌報導基因試驗法評估台灣河川中類雌激素物質之分佈
4960N029 李欣哲

2 摘要 　　環境中存在許多會影響生物體內分泌之化學物質，故具有內分泌系統之生物皆可能會受到這些外來物質的干擾而產生不良的影響。其中經由污水排放至水體中之類雌激素物質會模擬天然雌激素之生理行為，造成許多假刺激的作用與過多的不當反應，並且可能會阻礙雌激素受體之正常鍵結而產生直接或間接之作用，對人體或動物造成繁殖能力降低、性別異常、癌症腫瘤罹患率增加之影響。

3 前言 　　　由於化工產業的蓬勃發展，利用化學物質所生產之產品，在製程、使用及廢棄過程，均可能排出污染物。一般而言，具有立即性危害的化學物質大多已被禁用或管制。仍有許多微量污染物尚未被加以管制或規範。

4 　　　環境荷爾蒙一詞源於內分泌干擾物，Weybridge會議將之定義為：「外來物質能透過改變內分泌之功能，對完整的生物體或其後裔造成不幸的健康效應」。雖然環境荷爾蒙在環境中濃度極低，但經生物濃縮與食物鏈造成濃度放大之效應，可能於生物體內形成假性荷爾蒙，例如本研究針對之類雌激素內分泌干擾物質具有模仿或抑制雌激素於生物體內作用之能力，可和雌激素器結合，進而造成生物體於生殖系統之損傷。目前已有研究發現，因大量家庭污水及工業廢水之產生與排放，環境水體中已檢測出類雌激素物質之存在。

5 材料與方法 1. 採樣及前處理水樣蒐集以環保署全國環境水質監測網所公告污染程度較高之河川流域為主，由每條河川上游至下游選取三至十個採樣點，於淡水河、鹽水溪、二仁溪、阿公店溪及高屏溪採樣，採樣資訊如表1所示。針對淡水河僅採集河川中游人口密集之區域，於污染較為嚴重之鹽水溪、二仁溪則有較完整之採樣及監測。

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7 2. 生物試驗法實驗本研究使用之基因重組酵母菌檢定法於1996年由Routledge及Sumpter所發展，其機制如圖1所示，在酵母菌基因體上轉殖入人類雌激素受器基因，並將具有ERE、PGK promoter及Lac-Z 基因之質體載入細胞內。當類雌性激素進入細胞內與其受器反應形成複合物時，將進而與ERE產生反應，誘導下游產生β-galactopyranoside，此酵素會分解培養液內所添加之CPRG反應， 使培 養液由黃色轉紅色， 因此可由顯色之吸光值估算類雌激素含量。

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9 　　基因重組酵母菌檢測法以17β-estradiol (E2)作為標準品，並以DMSO作為空白樣品。實驗流程為將標準物質E2及濃縮樣本進行系列稀釋後依序 加入微盤中，並添加於28℃下培養24小時之菌體及CPRG發色劑作為檢測用基質。於32℃培養三天後，以微盤測讀儀測定其於波長540nm及620 nm之吸光值，計算出校正值，運算公式如下。量濃度(E2-EQ-ng/L)，換算公式如下。利用上述方法製作檢量線，而由樣本之校正值配合四參數法可計算出E2當校正值 = 樣本吸光值(540 nm) - [樣本吸光值(620 nm)-空白樣本(620 nm) ]

10 3. HPLC分析樣本經生物檢定法檢測後，將活性誘導程度較高之樣本以HPLC進行分離，並利用甲醇與水於不同時間下調整配比，以增加樣本分離效果，其操作條件如表2。將分離後之樣本以每分鐘為單位收集 (0~40分鐘共40管)，並以真空減壓離心濃縮機蒸乾後，再加入DMSO溶出以進行生物試驗，實驗架構如圖2所示。

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13 問題與討論 1. 淡水河類雌激素活性之評估於兩次採樣及分析中，發現 2009年10月於DS1所測得之E2當量濃度含量明 顯略高(圖3(a))，2010年7月份則於DS3有活性誘導產生(圖3(b))，但E2當量濃度 (7.0 E2-EQ-ng/L,Conc. Factor=10) 低於2009 年10月DS1之值(20.8 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)。兩次分析結果顯示各樣本於濃縮倍率十倍時皆有輕微至中、高 度的誘導情形，初步了解此段河川中類雌激素物質含量可能有略高之情形。

14 2. 鹽水溪類雌激素活性之評估於2010年1月之樣本中，以YS2之活性誘導為最高(19. 6 E2-EQ-ng/L, Conc
2. 鹽水溪類雌激素活性之評估於2010年1月之樣本中，以YS2之活性誘導為最高(19.6 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)，其次為YS4(10.2 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)及YS5(8.3E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)(圖3(c))。於2010年4月之水樣中，上游YS1、YS2 較無明顯活性誘導，YS3之活性誘導略高(5.9 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)，而 YS4(8.1 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10)及 YS5之活性誘導最高(15.6E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=10) (圖3(d))。2010年1月與4月之YS3於高濃縮倍率下皆有抑制酵母菌生長之情形產生，而4月採集之樣本中類雌激素物質污染情形 高於1月份之樣本。

15 3. 二仁溪類雌激素活性之評估於2010年1月樣本中(圖3(e))發現在支流兩點之ER1 (481. 1 E2-EQ-ng/L, Conc
3. 二仁溪類雌激素活性之評估於2010年1月樣本中(圖3(e))發現在支流兩點之ER1 (481.1 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=1)及ER3 (31.1 E2-EQ-ng/L, Conc. Factor=1)有非常高的活性誘導產生，於主流下游部分 ER4 亦有高活性的誘導 (12.1 E2-EQ-ng/L,Conc. Factor=1)。於同年3月進行第二次採樣(圖3(f))，並於主流上游至下游多增加六個採樣點，發現二仁溪主流部分較無明顯之活性誘導，但支流ER1亦有類雌激素活性誘導之情形 (39.0 E2-EQ-ng /L, Conc. Factor=1)，但其E2當量濃度較1月份低，且ER3及ER4無明顯活性誘導。

16 4. 阿公店溪及高屏溪類雌激素活性之評估於阿公店溪的三個採樣點中，發現AGD2有高活性誘導(94. 2 E2-EQ ng/L,Conc
4. 阿公店溪及高屏溪類雌激素活性之評估於阿公店溪的三個採樣點中，發現AGD2有高活性誘導(94.2 E2-EQ ng/L,Conc. Factor=1, 圖3(g))。高屏溪支流部分GP5亦有發現輕微的類雌激素活性誘 導(Conc. Factor=1時，活性過低無法計算E2當量濃度)，但於高屏溪主流部分並皆無發現明顯活性誘導(圖3(h))。

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19 5. 生物檢測法結合儀器分析法本研究取二仁溪及鹽水溪中活性最高之樣本ER1及YS3，利用液相層析儀進行初步分離，以每一分鐘為單位收集分段樣本，再以生物試驗法進行生物檢測後，發現二仁溪ER1及鹽水溪YS3在兩次採樣分析試驗中於18~20分鐘皆有明顯活性 誘導產生。於相同條件下注入雙酚A標準品並比對停留時間及光譜之吸收波長，懷疑該分段樣本之類雌激素活性可能為雙酚A所誘導。此外，根據分段樣本之活性分佈，推論三月份可能有新的污染物質排入二仁溪(圖4(b))。

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21 結論 　　利用生物試驗法進行快速檢測，並配合儀器分析來篩檢河川水體之類雌激素物質污染情況，更可達省成本及省時的效果。本研究發現台灣河川水體中，鹽水溪及二仁溪為類雌激素物質嚴重污染區域，經由 HPLC 分析後初步懷疑水樣中可能含有高濃度之雙酚 A，未來將再以液相層析串聯式質譜儀做進一步之確認與濃度分析。此外，淡水河兩次採樣中各點皆有輕微至中度誘導之情形產生，表示淡 水河人口密集之中游處類雌激素物質含量亦有略高之情形。阿公店溪中游部分有略高之活性誘導，而於高屏溪支流及下游則有輕微之活性誘導。未來將持續採樣監測，並且配合儀器分析方法，以期能建立台灣各河川類雌激素物質污染分佈之情形。

22 參考文獻 1. 丁望賢、吳建誼，“環境荷爾蒙-壬基苯酚與雙酚 A 在臺灣水環境中之分析與 流布調查”，環檢雙月刊，第三十三期，第 9-12 頁(2000)。 2. 內政部營建署，全國污水下水道用戶接管普及率及整體污水處理率統計表，(2010) Mueller S.O., Xenoestrogens: mechanisms of action and detection methods, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378 (3) (2004). de Vlaming V., Biales A., Riordan D., Markiewicz D., Holmes R., Otis P., Zander R., and Lazorchak J., Screening California surface waters for estrogenic endocrine disrupting chemicals (EEDC) trout liver vitellogenin with a juvenile rainbow mRNA procedure., Science of the Total Environment, 385 (1-3) (2007). Sumpter J.P., and Johnson A.C., Lessons from endocrine disruption and their application to other issues concerning trace organics in the aquatic environment., Environmental Science & Technology, 39 (12) (2005).

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