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氨基酸序列熵值计算工具的实现 及其在A型流感病毒HA蛋白序列 分析中的应用
王靖飞 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 昆明
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前 言 A型流感病毒HA蛋白氨基酸序列中特殊位点的突变对其抗原性、毒力、受体结合特性等有显著影响
前 言 A型流感病毒HA蛋白氨基酸序列中特殊位点的突变对其抗原性、毒力、受体结合特性等有显著影响 这些特殊位点的识别和其突变规律的揭示对流感病毒疫苗、致病机理、跨宿主传播等研究具有重要意义 氨基酸序列最大熵可以用来反映氨基酸位点的保守性和可变性
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HA氨基酸序列熵值计算流程 序列文件 ClustalX 对齐 对齐文件.fasta 熵值计算工具Entropy 熵值计算，保守区和可变区分析
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熵值计算工具——Entropy的开发 开发环境：Microsoft Visual Studio .NET 2003 开发语言：C#
主要技术：文件流、ADO.NET等 主要控件：DataGrid、OpenFileDialog等
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Entropy的功能介绍 1、熵值计算 利用熵值计算公式计算每个序列集各位点的熵值。 2、保守序列
保守序列定义：每个位点出现概率最多的氨基酸的值。并针对可能出现的情况对每个位点的显示形式加以区别。 3、数量统计 以数量的形式显示每个序列集，每个位点各种氨基酸的数量。 4、百分数统计 以百分比的形式显示每个序列集，每个位点各氨基酸占总氨基酸数量的百分比 。
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Entropy的界面
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Entropy的应用——序列数据获取 从NCBI的流感病毒资源数据库采集流感病毒HA蛋白氨基酸序列。选择A型流感病毒、任意宿主、任意地区、HA片段，H3/H5亚型、仅选择全长序列、移除同一序列,其余条件系统默认。符合条件的序列集有832/932条序列（至2007年7月16日）。分别命名为SetH5和SetH3。取得的序列统一制成FASTA格式
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Entropy的应用——多序列比对1 ClustalX装载序列后，杂乱无章
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Entropy的应用——多序列比对2 序列比对后，适当的引入空位，比对结果整齐有序
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Entropy的应用——多序列比对3 已对齐的SetH3
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Entropy的应用——多序列比对4 已对齐SetH5
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Entropy的应用——对齐序列编辑1 箭头所示，由于该位点仅一条序列插入一个N致使其余序列全部产生空位，切除N后该位点对齐
比对后的序列利用Bioedit软件进行编辑，将氮端或碳端部分冗长序列切除，或删除个别序列个别位点的氨基酸插入
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Entropy的应用——对齐序列编辑2 已编辑SetH3
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Entropy的应用——对齐序列编辑3 已编辑SetH5
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Entropy的应用——编辑后再次对齐分析
已编辑SetH5（切割位点附近有大量碱性氨基酸插入）
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Entropy的应用——数据输入
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Entropy的应用——数据输入 已装载序列
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Entropy的应用——熵值计算
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Entropy的应用——结果显示（熵值）
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Entropy的应用——结果显示（保守序列分析）
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Entropy的应用——结果显示（氨基酸数量统计）
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Entropy的应用——结果显示（氨基酸出现概率）
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Entropy的应用——多数据集分析 226位点对比结果
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Entropy的应用——熵值判断标准 根据熵值计算公式可以推导出氨基酸序列比对时，熵值的范围在0～4.392之间（只有一个氨基酸残基出现在当前位点时熵值为0；所有20个氨基酸残基，包含氨基酸残基缺失或插入产生的空位，均匀的出现在当前位点时熵值为4.392） 通常认为熵值≥2.000时该位点是可变异的，当熵值＜2.000时认为该位点是保守的，当熵值≤1.000时该位点是高度保守的。关于熵值的保守性定义可以结合比对对象特征定义 在此，我们定义熵的范围（0～4.392），缺省值设置是1.000。 H≥1.000， 代表高突变位点； 1.000 ≥H ≥ 0.600， 定义为易突变为点； H≤0.600， 定义为保守位点
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Entropy的应用——分析结果1 ■代表高突变位点，△代表易突变位点 上面是H3数据，下面是H5数据
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Entropy的应用——分析结果2
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Entropy的应用——分析结果3
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Entropy的应用——分析结果4
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讨论与结论1 研究表明，H3和H5亚型HA蛋白氨基酸序列的熵值差异较大，所以氨基酸残基位点突变比率相差也较大，尤其是功能区和功能位点差异最为明显 1、受体结合区熵值相对较小，表明氨基酸位点相对保守，说明A型流感病毒各亚型受体具有较强的宿主特异性，相对比较保守。 2、抗原表位区H3的熵值普遍高于H5，H3亚型较H5亚型更易发生抗原漂移。结合已有研究成果，这种变化主要来自宿主免疫系统的选择压力，进一步可以验证人类免疫系统对流感病毒的选择压力高于禽类。
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讨论与结论2 3、H3亚型137、226位点熵值为分别为1.691和1.865，具有较高的突变率。而226位点位于受体结合位点“Pocket”（袋状蛋白）的底部，在和唾液酸结合过程中作用重要，这一位点氨基酸残基易于突变，表明H3亚型流感病毒在和宿主细胞表面的受体作用时具有不同的结合常数。即同一亚型病毒与相同受体结合时，结合力稳定性不同，因此可以表现出不同的毒力 。 4、同一亚型不同抗原表位的熵值也不同。经验表明，突变率高的抗原表为通常为病毒的主要抗原表位。如，H3亚型表位A和表位B位主要抗原表位；H5亚型表位B为主要表位。 5、应用Entropy可以方便地进行氨基酸序列保守区分析，同时也可以对多个数据集的分析结果进行比较分析，以发现数据集的聚类特征。
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