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植物基因組DNA的提取 ~檢驗基因改造黃豆 授課教授：傅士峯老師 助教：呂學宇、張凱雅 值日組：G1 104/09/16
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今日上課流程 開始上課 萃取植物 DNA 測量核酸濃度和純度 電泳跑膠 交代回家作業
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實驗目的 植物基因組 DNA 編碼遺傳訊息，藉由此 調控生長發育、生殖、生理等；故本次實 驗將介紹萃取植物 genomic DNA 原理和操 作法，以便後續進行基因體研究（e.g. PCR, Southern blot）
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萃取基因組 DNA 步驟 沉澱核酸和去除 RNA 去除多糖、多酚等 二次代謝產物 蛋白質變性與分離 打破細胞 濃縮 DNA
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實驗原理
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植物基因組 DNA 提取方法 (一) CTAB 法 (二) SDS 法 (三) Phenol-Chloroform 法 (四) PVP 法
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Phenol-Chloroform 法 萃取步驟 打破細胞、Phenol-Chloroform 去除雜質、 Phenol 苯酚
乙醇沉澱 DNA、去除殘留 Chloroform Phenol 苯酚 沉澱蛋白質和脂質 Chloroform 三氯甲烷（氯仿） 跟非極性分子結合，並使其沉澱
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Phenol-Chloroform 法
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Phenol-Chloroform 法
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Phenol-Chloroform 法
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Phenol-Chloroform 法
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Phenol-Chloroform 法
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Phenol-Chloroform 法
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核酸濃度和純度的測定 紫外分光光度法 (一)濃度測定 紫外光波長 260nm 1 OD ≅ 50 𝜇g/ml 雙股 DNA
DNA濃度＝OD260×50×稀釋倍數 只適用於測定濃度大於 0.25 𝜇g/ml 的核酸溶液
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核酸濃度和純度的測定 紫外分光光度法 (二)純度測定 藉由 A260 /A280判斷有無蛋白質、酚類污染 最大吸收波長 DNA：260nm
RNA：230nm 蛋白質：280nm 純 DNA : A260 /A280=1.8 A260 /A230=2.0
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核酸分子量鑑定 瓊脂糖凝膠電泳法 原理：電荷效應、分子篩效應 靈敏度：10 ng （10-8g） 遷移率 α 1 分子量對數 UV
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實驗材料 冰100% ethanol (2.5X volume of samples)=50 mL
冰3M sodium acetate pH5.2 (1/10 volume of samples)=50 mL 冰75% ethanol=50mL TriSolution Chloroform Tube 1.5 mL 研缽
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DNA 純化步驟 秤量植物組織 (0.1 g~10個黃豆胚芽)，加入1 ml TriSolution Plus 試劑，研磨均質化
將所有上清液取出 丟棄剩餘植物組織碎片 將上清液加入 200 µl 的 Chloroform，來回用力翻轉離心管數次 離心20000 × g 4℃ 離心1 5 分鐘 共分上中下層 ~吸出上層(RNA)並丟棄 (※重要※)保留並取中間層含DNA 加入 300 µl 的 100％ ethanol，來回用力翻轉離心管數次 室溫靜置 2～3 分鐘，以 × g 4℃ 離心 5 分鐘 此時 pellet 會形成在管柱底部，去除上清液 加入200 µl 水回溶DNA 加入20 uL Sodium acetate (1/10 體積)與500 uL 冰的100%EtOH (2.5X體積)(冰) -70度反應 10 分鐘 以 20000× g 4℃ 離心 5 分鐘 之後倒掉上清液 保留Pellet(重要肉眼看一下有無Pellet) 以100 µl 75％ ethanol (冰) 清洗 (加入75% ethanol 後 再立即倒出 ) 放於Hood 下烘乾 以30 µl 水回溶DNA
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核酸濃度和純度的測定 Nanodrop 超微量分光光度計 測 DNA 純度/濃度 A260 /A280 A260/A230
推測 Concentration
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電泳跑膠 M G1 G2 ．．． G13 2 µl DNA+ 2 µl Dye（ parafilm 上混勻 ）
電泳跑膠 35 分鐘 Marker : 14 K M G1 G2 ．．． G13 2 µl DNA 2 µl Dye Parafilm
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結果與討論
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報告繳交 (範例) 組別作業 繳交期限
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