第五节 细胞分子生物学研究方法.

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1 第五节 细胞分子生物学研究方法

2 一、原位分子杂交技术 DNA变性: 当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下, 维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离 成两条单链,这一过程叫DNA变性。 DNA复性: 当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂 解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一 过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。

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5 核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。

6 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行
杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。

7 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）

8 二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）
又叫体外基因扩增技术。 利用人工合成的一对引物， 在被扩增DNA模板链的两端 形成双链，由DNA聚合酶催 化一对引物之间的聚合反应。

9 具体过程： ① 变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链 变成单链 ② 退火：降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合 ③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引 物3’端进行延伸，使原模板DNA的一条链变成 两条链。

10 三、反义技术 反义核酸技术主要是引入目的基因mRNA的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交而阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列互补配对后，用于表达目的基因的mRNA量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少

11 反义技术的应用： ① 基因功能的研究 ② 病毒基因组功能的研究 ③ 作为药物 ④ 抗肿瘤作用

12 四、基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内使之在细胞内 实现转入基因的扩增或表达的技术。它是重组DNA、基 因功能研究、基因治疗的关键技术之一。 方式： 转化 转染

13 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。

14 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

15 影响转染效率的主要因素有： 1、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。

16 2、血清     大多数培养基在使用前需要加血清。通常血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。

17 3、载体构建 转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。

18 4、DNA质量 DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。

19 5、转染技术     转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

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21 五、基因敲除与敲进 基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。 基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。

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23 意义： ① 研究基因功能 ② 转基因动物的制备 ③ 用于药物筛选的动物模型 ④ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物