仪器分析 第八讲 主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时：32　.

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1 仪器分析 第八讲 主讲教师：刘忠英　　　　　　　　　　　　　　　　　　　学时：32　

2 第十一章 荧光分析法 光致发光 某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种现象称为光致发光。
第十一章 荧光分析法 光致发光 某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种现象称为光致发光。 荧光 物质分子接受光子能量激发后，由激发态的最低振动能级下降到基态时发射出的光为荧光。 荧光分析法 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据 荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法。

3 种类：分子荧光，原子荧光。(紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等)。
特点： （1）荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品量很少，检测限低10-10 ~ 10-12g/mL。 （2）荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛。

4 一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、 荧光分光光度计

5 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程
第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，电子 自旋方向不改变，为激发单 重态； 以、S0 、 S1* 、 S2*表示. 如果电子在跃迁过程中，伴随 着自旋方向的改变，这时便 具有两个自旋不配对的电子， 这种受激态称为激发三重态； 以T1* 表示.三重态的能量较低。

6 2.荧光的产生 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外－可见光后，基态分子中的电子跃迁到激发单重态的各个不同振动－转动能级，（不能直接跃迁到激发三重态的各个振动能级）。 处于激发态的分子是不稳定的，以辐射跃迁和非辐射跃迁的方式释放能量，返回基态。

7 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子
非辐射能量传递过程 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子 间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分 子，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内转换：当激发态S2*的较低振动能级与S1* 的较高振动能 级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2*的振动能级以无 辐射方式过渡到S1*的能量相等的振动能级上的过程。

8 外 转 换： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；从S1*、 T1* 最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃: 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S1*—T1* 跃迁，这一过程称为 “体系间跨跃” 。

9 荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。
磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。

10 S : 基态 S1*, S2 *: 激发单重态 T1* : 激发三重态 λ1, λ2 : 激发光 λ 3 : 荧光 λ 4 : 磷光 分子吸收和发射过程的能级图

11 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级； 磷光：10-4～10s, 第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级； 传递途径 振动弛豫 无辐射跃迁 辐射跃迁 磷光 系间跨越 内转移 外转移 荧光

12 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都具有两种特征光谱 物质吸收了一定频率的光，称为激发光；
物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。 激发光谱（excitation spectrum） : 如果将激发光的光源用单色器分光，连续测定不同波长激发光照射下，荧光强度的变化所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱。实际上荧光物质的激发光谱和它的吸收光谱极为相似。 荧光光谱（fluorescence spectrum） : 固定激发波长和强度（一般在激发光谱中最大激发波长处），检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。 激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据

13 硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱

14 荧光光谱的特点： ① 与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；
② 荧光光谱与激发波长无关。电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 ③ 吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。

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16 二、荧光与分子结构 一种物质分子能否发射出荧光，取决于它的结构特征 ①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构；
②物质分子在吸收了一定频率的紫外光之后，必须具有较高的荧光效率。 荧光物质的重要发光参数荧光寿命和荧光效率。

17 发荧光的分子数目与基态分子吸收激发光的光子数的比值即
荧光寿命：除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间. 利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。 荧光效率：荧光量子产率 发荧光的分子数目与基态分子吸收激发光的光子数的比值即 荧光效率

18 (二)荧光与分子结构的关系 1.碳原子骨架----具有共轭双键体系的分子。能够吸收紫外可见光，易发生π→π*或n→π*跃迁， π电子的共轭程度越大，越易被激发而产生荧光，荧光强度越大，荧光波长也长移。 ─(CH=CH)2─ φ=0.28 ─(CH=CH)3─ φ=0.68

19 2. 分子的几何排布--分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。
刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。 如荧光素和酚酞有 相似结构，荧光素 有很强的荧光，酚 酞却没有。 3. 取代基 给电子，增加共轭程度 －NH2、－OH、－OCH3 荧光效率提高，长移 吸电子，减弱共轭程度 －COOH、－Cl 荧光效率减弱，短移 对共轭作用小，－R ，对荧光影响不明显

20 （三）荧光试剂 提高灵敏度和选择性 荧光胺－与脂肪族、芳香族伯胺形成衍生物275nm、390nm，480nm
丹酰氯－伯仲胺及酚基的生物碱 无机离子－有机物 形成配合物 －－荧光 （还有一些干扰物荧光减弱或熄灭）

21 Fura-2是一种荧光指示剂可与胞内的游离钙离子特异结合，其游离（未结合）形式的Fura-2比与钙结合形式的Fura-2在更长的波长上被激发， 即：结合形式的Fura-2激发波长为340nm，游离形式的Fura-2激发波长为380nm。 因此通过检测两个激发波长上荧光强度的比率，就可以确定 结合钙的Fura-2与未结合的Fura-2的比例，进而可求游离Ca 2+的浓度。

22 三、影响荧光强度的外部因素 （1）温度：荧光强度一般随温度降低而提高，
有些荧光仪的液槽配有低温装置，使荧光强度增大，以提高测定的灵敏度。在高级的荧光仪中，液槽四周有冷凝水并附有恒温装置，以便使溶液的温度在测定过程中尽可能保持恒定。 （2）溶剂：溶剂能影响荧光效率、荧光强度； 溶剂极性增强，荧光强度增强； 溶剂极性粘度降低，荧光强度减弱； 因此，在测定时必须用同一溶剂。

23 因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。
（3）酸度：荧光光谱和荧光效率常与溶液的酸度有关， pH<2 无荧光 蓝色荧光 >13 无荧光 表明产生荧光的是苯胺分子 因此，须通过条件试验，确定最适宜的pH值范围。

24 （4）荧光熄灭剂 荧光淬灭：荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降、消失,或荧光强度与浓度不呈现线形关系的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。 定量：荧光强度的减弱—正比—荧光熄灭剂 （5）散射光 光子与物质分子 方向改变，波长不变－－－瑞利散射 方向改变，波长改变－－－拉曼散射 选择适当溶剂、适当的波长 干扰荧光

25 第二节 荧光定量分析方法 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。 I0 It F 一、荧光强度与物质浓度的关系 F = φIa 其中 Ia = I0- It I0 ——入射光强度； It ——透射光强度； φ ——荧光效率（荧光量子产率）

26 根据朗伯-比尔定律 Ia=I0-It=I0(1- e-2.303εbc) ∵ F = Iaφ = 2.303 φ I0 εbc
根据朗伯-比尔定律 　　 Ia=I0-It=I0(1- e-2.303εbc) = I0 εbc ∵ F = Iaφ 　 = φ I0 εbc ∴ F = KC (K = 2.303φI0εb) 当I0一定并且浓度C很小时(A＜0.05),溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质的浓度成正比，即 F = K·C 上式为荧光定量分析的基本关系式。

27 F c 一般当εb c  0.05 时, F 与c呈线性关系； 荧光分析测定的是弱背景上的荧光强度，其灵敏度 取决于检测器的灵敏度，经过光电倍增管和放大器， 可以检测微弱的荧光信号。

28 定量测定 cx 荧光分析法的定量测定方法较多，常用的有以下两种。
（1）标准曲线法：将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。 C F 标准工作曲线图 Fx cx F = K C

29 （2）比例法（直接比较法）：配制已知对照品溶液的浓度Cs，测定其荧光强度Fs，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx ,便可求得试样中荧光物质的含量Cx 。 如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度F0，然后进行计算。 C F s - F s = F F 求出Cx C x --__ x （3）联立方程法：多组分混合物的荧光分析

30 定性分析 在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱。
荧光物质的光谱包括激发光谱和荧光光谱两种。因此，鉴定物质的可靠性较强。 当然，必须在标准品对照下进行定性。

31 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角
第三节 荧光分光光度计 由光源、单色器、样品池、检测器和记录系统五部分组成。 样品池 显示器 单色器 检测器 I0 It IF 光源 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角

32 光源 一般由氙灯提供。在200nm—700nm能发射连续光谱，且强度大,为荧光物质的激发提供光能。 氙灯结构示意图

33 单色器(两个) 滤光片荧光计：激发滤光片让激发光通过；发射滤光片用截至滤光片，只用于定量分析。
滤光片-单色器荧光计：用光栅代替发射滤光片，可测荧光光谱。 荧光分光光度计：激发滤光片和发射滤光片都由光栅代替，可绘制激发光谱和荧光光谱。

34 3．样品池 用来盛放待测溶液。比色杯由石英材料制成，比色杯以方形为主,四壁透光。 4．检测器 检测待测物质所发射的荧光信号。将光信号转变为电信号，进而以数字形式输出。

35 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：
a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。

36 荧光检测法（fluorescence detector, FLD）应用
 是一种选择性检测方法，只能用于具有荧光活性的化合物（如含有芳香基团的化合物）的检测，灵敏度可比UV检测器高2-3个数量级，检测限可达pg量级或更低。  对无荧光活性的物质，可在样品或高效液相色谱系统中加入荧光试剂进行柱前或柱后衍生化，以实现高灵敏度检测。  在芳烃、甾族化合物、氨基酸、维生素、酶和蛋白质及体内药物分析中，荧光检测法是较为理想的高效液相色谱检测方法，其主要缺点是样品适用范围有限。

37 生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质. 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质. 荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构； 致癌物同核酸结合常引起显著的荧光； 无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧光络合物。

38 其它荧光技术 Δ λ ＝ λmaxEX－λminEM 尖而窄的同步荧光峰 激光荧光分析：以激光为光源，单色性好，强度大。
时间分辩荧光分析：物质的荧光寿命时间差。 同步荧光分析： Δ λ ＝ λmaxEX－λminEM 尖而窄的同步荧光峰