第六章 细胞融合 (Cell fusion).

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1 第六章 细胞融合 (Cell fusion)

2 6.1 概述 细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic
6.1 概述 细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic hybrydization）或细胞杂交（cell hybrydization ）： 在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型 的单细胞通过无形方式融合成一个杂合细胞,生产 特殊生物制品、分化再生新物种或新品种的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。 目前被广泛地应用于单克隆抗体、生物的远缘杂 交、新品种的培育和人类基因图工作（小鼠和人类 细胞融合）。

3 6.1 概述 体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎 动物肿瘤细胞的多核现象。其后发现骨髓、肺组织
6.1 概述 受精：雌雄生殖细胞间的自然融合。 体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎 动物肿瘤细胞的多核现象。其后发现骨髓、肺组织 和各种正常组织及炎症和坏死部位的多核现象。 实验体细胞融合：在细胞培养技术之后。首先 （Lambert）发现体外培养的肿瘤细胞自发融合。 后（Okata,1962）发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤 细胞融合，开创了动物细胞融合的崭新领域。其后 不同动物细胞、植物和微生物原生质体融合技术也 相继发展起来。

4 6.1.1 细胞融合的意义 细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动 物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新
细胞融合的意义 细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动 物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新 物种或新品种的技术。 意义：可应用于优先选择改良、克服远缘杂交中的 不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传 性状，从而培养出理想的品种。可以避开生殖细胞的 受精过程，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转 移，创造出自然界中所没有的新物种或杂合细胞。还 可创造细胞质杂种。

5 6.1.2 细胞融合的原理和融合材料 1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞→融合细 胞→新生物（或杂合细胞）。
细胞融合的原理和融合材料 1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞→融合细 胞→新生物（或杂合细胞）。 两种不同植物的体细胞经纤维素酶、果胶酶消化，除去细胞 壁，得到原生质体（或动物细胞），通过化学或物理方法诱导 其细胞融合形成杂种细胞；以适当的技术进行杂种细胞的分拣 和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直到分化 发育成杂种植株，实现基因在远缘物种间的转移。 2、融合材料 （1） 植物或微生物原生质体的制备 （2）  动物单个细胞的获得 获得步骤： （1）  组织的获得、（2）  组织的消化、（3）原生质体或动 物单细胞的分离。

6 6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.1 原生质体的制备 1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。
原生质体的制备与培养 原生质体的制备 1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。 2. 制备原生质体：机械法；酶解法 酶解法：（1）   取材消毒 （2）   酶解制备 （3）   原生质体收集 3.  原生质体的纯化方法 过滤-离心法； 漂浮法； 沉降法和漂浮法结合

7 6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.2 原生质体培养方法： （1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于 液体培养基中培养。
原生质体的制备与培养 原生质体培养方法： （1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于 液体培养基中培养。 （2） 固体平板法：固体培养基上培养。类似植 物单细胞培养法 （3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄 层液体原生质体培养液培养原生质体

8 6.1.4 动物单个细胞的获得 动物单细胞的获得： 1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯
动物单个细胞的获得 动物单细胞的获得： 1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯 中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离 心，留下组织块。 2、组织的消化：胰蛋白酶消化： ①向组织块中加入30~50倍体积的胰蛋白酶液。 ②37℃水浴内消化，每5~10分钟摇一次。 ③Hanks漂洗两次。 ④800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。

9 6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择 细胞融合技术主要有： 生物法——仙台病毒法 化学法——PEG结合高Ga2+、pH诱导法
6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择 细胞融合技术主要有： 生物法——仙台病毒法 化学法——PEG结合高Ga2+、pH诱导法 物理法——电融合诱导法 融合细胞的选择： 融合细胞的类型：同核体；异核体；多核体。 常用的选择方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选 法；生长特性筛选法；物理特性筛选法；其他方法

10 6.2.1 生物法——仙台病毒法 灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使 细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）：
生物法——仙台病毒法 灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使 细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）： 1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞 膜间相互渗透，胞质互相渗透。 3.两个原生质体的细胞核相互融合，融为一体。 4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色 体的杂种子细胞。

11 PEG法诱导原生质体的机制尚不十分清楚，初步分
化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导 PEG法诱导原生质体的机制尚不十分清楚，初步分 析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体 表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使 异源的原生质体间的黏着而结合。用高钙离子和pH 溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗脱，导致电荷平 衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连 接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。

12 6.2.2 化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导 1. 做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型抗 性等。
1. 做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型抗 性等。 2. 两种原生质体（密度105个∕ml）按1:1等量混合。 3.PEG的分子量为4000~6000，加热融化与Eagle溶液配 成50%。加入PEG后，24℃培育10~20min，缓缓加入高 pH、高钙离子液,15分钟后冲洗液冲洗，离心收集原生质 体。 4.计算融合率 融合率=（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的 细胞核总数）×100%

13 6.2.3 物理法——电融合诱导法 是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉 冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位
物理法——电融合诱导法 是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉 冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位 发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破 裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融 合体。 优点：融合率高、重复性好、对原生质体伤害 小、装置精巧、方法简便、可在显微镜下观察或录象 融合过程、诱导过程可控性强等。

14 在交流电场中原生质体排列成念珠状、发生融合
A 平行多电极融 合装置示意图 B 电融合微室示意图 上：俯视图 :下侧面图 电融合设备及原理图

15 6.2.3 物理法——电融合诱导法 电融合诱导法： 1. 亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小
物理法——电融合诱导法 电融合诱导法： 1.  亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小 室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3㎜，整个装置放在 一个培养皿中。 2.  微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜 表面接触，5~12mA脉冲电流刺激1~5mS,原生质体在累计几秒 到几十秒时间内暂时收缩，两膜间形成小孔，连接成桥，经 点到面完成连接，最后形成融合体。 3.  经平行电极的1兆赫交流双向脉冲，原生质体极化产生偶极 子，紧密排列成串珠状。在适当时间和强度的直流电（如50 mA，1.2~2kV∕㎝）脉冲作用下，击穿质膜，成融合体。

16 6.2.4 细胞融合的影响因素 植物细胞融合效率与外界条件有关： （1）PEG诱导融合：关键是作用时间。尤其是高钙离子和pH 溶液处理时间。
细胞融合的影响因素 植物细胞融合效率与外界条件有关： （1）PEG诱导融合：关键是作用时间。尤其是高钙离子和pH 溶液处理时间。 （2）PEG规格和纯度与融合效率有关。 （3）电场诱导融合：融合率与原生质体密度有关。（最适 2×104~8×104） （4）融合液中加少量氯化钙，可维持一定电导率，对细胞有 保护作用；电流强弱、处理时间、电脉冲大小会影响融合率。 （5）在促融剂中添加刀豆蛋白、胰蛋白酶、精胺、亚精胺 等可提高融合效率。

17 6.2.5 动物细胞融合 动物细胞融合过程中，促融剂、细胞性质、温度、pH、 离子强度、离子种类等影响融合效率。
动物细胞融合 动物细胞融合过程中，促融剂、细胞性质、温度、pH、 离子强度、离子种类等影响融合效率。 （1）亲本细胞表面性质影响较大。表面覆盖绒毛，不规则 者易融合，光滑者不易融合。 （2）细胞种类不同，融合效果不同。如腹水癌及株化细胞 易融合，淋巴和血细胞几乎不融合。 （3）细胞融合时需要适宜温度和运动（震摇）状态。 （4）细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融 合。有些细胞在无氧下也可融合。 （5）有些细胞融合时需要钙离子，否则不融合，细胞蛋白 质也发生变化。 （6）最适pH为7.4~7.8之间。此范围外，融合率较低。

18 6.2.6 融合细胞的筛选 1、融合细胞的类型： （1）同核体——同缘原生质体的融合体。 （2）异核体——非同缘原生质体的融合体。
融合细胞的筛选 1、融合细胞的类型： （1）同核体——同缘原生质体的融合体。 （2）异核体——非同缘原生质体的融合体。 （3）多核体——含双亲不同比例核物质的融合体。 2、筛选融合细胞的常用方法： （1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能 正常等位基因，纠正另外一个亲本的缺陷，从而令杂 种细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。 （2）抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素 和除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择细胞。抗性 突变体或抗性有差异者可用此法。

19 6.2.6 融合细胞的筛选 2、筛选融合细胞的常用方法： （3）生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分
融合细胞的筛选 2、筛选融合细胞的常用方法： （3）生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分 要求与反应的差异选择杂种细胞。如外源激素。 （4）物理特性筛选法：亲本原生质体大小、颜色、 漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种细胞。 （5）其他方法：显微操作技术也能把单个异核体分 离出来。双亲融合，则具有与双亲不同的荧光标记。 采用无毒荧光素标记双亲原生质体，融合后利用电子 荧光激活选择器自动分类和选择融合细胞。

20 现代植物细胞融合技术研究是从20世纪六十年 6.3 细胞融合技术的应用举例 代才开始的。1972年美国科学家卡尔逊开发出杂种
6.3 细胞融合技术的应用举例 现代植物细胞融合技术研究是从20世纪六十年 代才开始的。1972年美国科学家卡尔逊开发出杂种 烟草；1978年德国科学家梅歇尔斯首次将番茄与马 铃薯细胞融合成功，预示着地上结西红柿、地下结 土豆的新植物的可能。 1978年瑞士科学家埃勒门和美国的柯路斯将人 体的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合后培育 成含人体染色体的人造小鼠。近年，科学家利用以 细胞融合为核心技术的操作取得了很大科研成果。

21 6.3.1 动物细胞融合——单克隆抗体 英国科学家科莱尔和米尔斯坦（1975）合作 将适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细
动物细胞融合——单克隆抗体 英国科学家科莱尔和米尔斯坦（1975）合作 将适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细 胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，发现融合的杂交 瘤细胞具有双亲细胞特征，通过克隆化可使杂交 细胞成为单纯的细胞系。由此单克隆系可以获得 结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克 隆抗体。 动物细胞融合最具价值的成就是利用杂交瘤 技术生产单克隆抗体。

22 Burnet(1957)提出克隆选择理论：一种浆细胞只产
杂交瘤技术的基本原理 Burnet(1957)提出克隆选择理论：一种浆细胞只产 生一种类型的免疫球蛋白分子，那么，从一个单克隆 细胞产生的抗体分子就是单克隆的，且该单克隆抗体 具有独特的均一结构。此假定经各种实验得以证实。 将瘤细胞与B细胞融合，培养成既能产生单一抗 体，又能在体外快速生长的杂交瘤细胞。该杂交瘤细 胞群经单克隆化，持续分泌成分单一的特异性抗体， 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,MCAB）。 骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的混合物中有三种细 胞：没融合的两种细胞与杂交瘤细胞。

23 6.3.1 .1 杂交瘤技术的基本原理 1、亲本细胞的选择 （1）骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞本身不分泌抗体（保
杂交瘤技术的基本原理 1、亲本细胞的选择 （1）骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞本身不分泌抗体（保 障杂交瘤细胞产生单抗）；有无限分裂的能力；黄嘌 呤、鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT－）或胸 腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK－）——在HAT培养基中 不能生存增殖。 （2）B淋巴细胞：经特定抗原免疫能产生目的抗体 的淋巴细胞，且被免疫动物种系与骨髓瘤细胞一致或 相近亲缘关系。

24 6.3.1 .1 杂交瘤技术的基本原理 2、培养基的选择（HAT培养基）： 为去除未融合的骨髓瘤细胞，在培养液中加次黄嘌呤
杂交瘤技术的基本原理 2、培养基的选择（HAT培养基）： 为去除未融合的骨髓瘤细胞，在培养液中加次黄嘌呤 （H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶脱氧核苷（T）。A 阻断正常细胞DNA合成主路途径（二氢叶酸到四氢叶 酸），故只有能利用H和T的正常细胞从旁路合成DNA 才不死亡（脾脏细胞有最高分裂次数或不分裂， 死亡） 骨髓瘤细胞：（ HGPRT－和TK－）无法利用旁路合成 DNA，主路又被A阻断，故单纯的瘤细胞不久即死亡。 杂交瘤细胞：具有瘤细胞（无限分裂的能力）特性和 野生型淋巴细胞 （ HGPRT+和TK+）旁路合成DAN的特 性，长期生存，从而被分离出来。

25 6.3.2 杂交瘤技术的过程 1、融合细胞的制备： （1）脾淋巴细胞： 1）经免疫的小鼠放血致死，无菌操作取脾脏， 去胞膜；
杂交瘤技术的过程 1、融合细胞的制备： （1）脾淋巴细胞： 1）经免疫的小鼠放血致死，无菌操作取脾脏， 去胞膜； 2）用RPMI-1640或DMEM培养液清洗，放在盛 10毫升培养平皿的双层铜丝网上； 3）用注射器内玻璃管芯将脾淋巴细胞轻轻挤压 到培养液中； 4）计数后将细胞液装入加盖离心管内，置于冰 箱备用。

26 6.3.2 杂交瘤技术过程 1、融合细胞的制备 （2）骨髓瘤细胞： 1）选择形态好的骨髓瘤细胞，加0.2%台盼蓝染
杂交瘤技术过程 1、融合细胞的制备 （2）骨髓瘤细胞： 1）选择形态好的骨髓瘤细胞，加0.2%台盼蓝染 液，计数（活细胞80%以上）； 2）1500r/min离心，弃上清液，加20ml培养液清 洗后再次离心。（可用于杂交融合）

27 6.3 .2 杂交瘤技术过程 2、细胞杂交融合： 1)按4:1~10:1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞混匀于同 一离心管中；
杂交瘤技术过程 2、细胞杂交融合： 1)按4:1~10:1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞混匀于同 一离心管中； 2）离心，弃上清液，置于37℃水浴，摇动离心管逐 滴加入1 mlpH7.2~7.6的50%PEG4000，1分钟内完成， 水浴中继续摇动1~2分钟； 3）沿管壁逐滴加入10ml培养液，混均稀释PEG，终 止诱导作用； 4）1000r/min迅速离心1分钟，弃去上清液。

28 6.3.2 杂交瘤技术过程 3、分装培养： （1）离心后的混合细胞中加HAT培养液，使浓度 为：2×105个细胞∕0.1ml培养液；
杂交瘤技术过程 3、分装培养： （1）离心后的混合细胞中加HAT培养液，使浓度 为：2×105个细胞∕0.1ml培养液； （2）96孔培养板中每孔加0.1ml细胞稀释培养液， 加盖密封，5%CO2培养箱37℃培养； （3）次日检查有无污染，若正常，换液——毛细 管吸出半量培养液，补充0.2mlHAT培养液，以后隔 日一换； （4）二周后改HT培养液，3~5次后改D-15液 （5）培养5~6天有杂交瘤细胞克隆出现，未融合的 脾细胞和骨髓瘤细胞5~7天后逐渐死亡。

29 6.3.2 杂交瘤技术过程 4、抗体检测 （1）抗原结合法：放射元素125I标记的抗原与杂交瘤
杂交瘤技术过程 4、抗体检测 （1）抗原结合法：放射元素125I标记的抗原与杂交瘤 培养上清液于37℃下温育，活性碳吸附，加PEG6000 与琼脂糖凝胶珠连接，使免疫复合物与其他抗原分 开。根据免疫复合物中放射级别可计算出抗体数量。 （2）第二抗体法：以杂交瘤细胞产生的抗体为抗原 的第二抗体用125I标记，再与酶连接或荧光染料连接， 以检测出杂交瘤抗体。

30 6.3.2 杂交瘤技术过程 5、杂交瘤细胞的克隆 一种抗原有多个抗原决定簇，故杂交瘤细胞会产生 许多种单克隆抗体。
杂交瘤技术过程 5、杂交瘤细胞的克隆 一种抗原有多个抗原决定簇，故杂交瘤细胞会产生 许多种单克隆抗体。 （1）有限稀释法：检测到有抗体后，杂交瘤细胞长 满小孔的1/3~1/2时，用含20%的BSA的HAT培养液将 其稀释成5个细胞/0.2ml和1个细胞/0.2ml两种浓度，另 外重新接种，每孔0.2ml，5%CO2培养箱37℃培养， 检查抗体。 一般应作三次有限稀释培养，2周左右，才能得到 稳定的单抗细胞株。

31 6.3.2 杂交瘤技术的过程 5、杂交瘤细胞的克隆 （2）软琼脂法：配制含0.5%琼脂的上述HAT培
杂交瘤技术的过程 5、杂交瘤细胞的克隆 （2）软琼脂法：配制含0.5%琼脂的上述HAT培 养液，用1~5个细胞/0.2ml的细胞液在培养皿中接 种，5%CO2培养箱，37℃培养。此法较容易获得 单个的细胞克隆

32 6.3.3 单克隆抗体的规模化生产 现在生物技术公司一般采用生物反应器悬浮 培养的方法生产单克隆抗体。
单克隆抗体的规模化生产 现在生物技术公司一般采用生物反应器悬浮 培养的方法生产单克隆抗体。 不同的方法生产单克隆抗体的纯度不同。在 生物医学领域中应用的单克隆抗体必须要求一定 的纯度。 培养过程中，加入培养液的胎牛血清蛋白 （BSA）完全血清由于其成分复杂而给提纯工作 带来难度。目前，很多研究人员都在开发研究无 血清培养基替代动物血清。

33 6.4 单克隆抗体技术

34 6.4.1 单克隆抗体技术的原理 1. HAT选择原理 利用HAT选择性培养液和突变细胞株解决了分离杂 交瘤细胞的困难。
单克隆抗体技术的原理 1.  HAT选择原理 利用HAT选择性培养液和突变细胞株解决了分离杂 交瘤细胞的困难。 2.  骨髓瘤细胞和淋巴细胞 亲本骨髓瘤细胞不分泌任何抗体或免疫球蛋白，否 则将影响单克隆抗体的产生。为代谢缺陷型，可被 HAT选择性培养液淘汰。淋巴（B）细胞分泌抗体， 野生型。 3. 杂交瘤细胞？ 4. 杂交瘤细胞单克隆化？5. 单克隆 抗体？

35 6.4.2 单克隆抗体技术过程 1、细胞培养材料的准备：培养基；血清；抗生素。 2、免疫动物：
单克隆抗体技术过程 1、细胞培养材料的准备：培养基；血清；抗生素。 2、免疫动物： ①动物选择：小鼠（纯系8周龄的BALB∕C）；Lou大 鼠；人细胞。 ②抗原与载体： 抗原：可溶性抗原：蛋白质、核酸、多肽、多糖（加 免疫佐剂，提高免疫效果）；颗粒性抗原：病毒、细 菌、真菌、细胞（抗原性较强，不加免疫佐剂） 。 载体：固定和缓慢释放抗原的惰性、无毒的物质（膜 体和珠体）。可溶性抗原固定在载体上成为颗粒性抗 原，被吞噬细胞吞噬和提呈，具较好的抗原性。 ③免疫途径：腹腔、皮下；加强——尾静脉。

36 6.4.2 单克隆抗体技术过程 3、亲本细胞的准备 ①脾细胞分离 ②小鼠骨髓瘤细胞 4、细胞融合 ① 细胞融合剂和融合手段：
单克隆抗体技术过程 3、亲本细胞的准备 ①脾细胞分离 ②小鼠骨髓瘤细胞 4、细胞融合 ① 细胞融合剂和融合手段： 病毒融合剂；化学融合剂；电融合技术。 ②融合技术：促融剂及浓度、细胞浓度与比例、温 度等。 ③提高融合频率的途径：秋水仙素预处理瘤细胞、 PEG和DMSO协同促融、饲养层、条件培养液 （CM）等。

37 6.4.2 单克隆抗体技术过程 5、融合细胞的筛选和克隆 ①融合细胞的筛选 筛选杂交瘤：第二抗体法、抗原结合法、功能筛选
单克隆抗体技术过程 5、融合细胞的筛选和克隆 ①融合细胞的筛选 筛选杂交瘤：第二抗体法、抗原结合法、功能筛选 法。筛选能产生目的抗体的杂交瘤。 ②融合细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂法 ③杂交瘤细胞及其单抗的鉴定： 染色体鉴定；特性鉴定；类别鉴定；单克隆抗体纯 度鉴定。

38 6.4.3 单克隆抗体的大量制备 1. 体外培养 满足实验室需要时，将对数生长期的杂交瘤细胞悬
单克隆抗体的大量制备 1.  体外培养 满足实验室需要时，将对数生长期的杂交瘤细胞悬 浮培养4~5天，离心收集上清夜，分装冻存备用。 生物医学领域应用的单克隆抗体须达一定纯度。培 养液中的血清干扰抗体的活性，也影响分离纯化，增 加生产成本。用无血清培养基培养杂交瘤和制备单克 隆抗体，使抗体易于纯化，且能避免可能来自血清的 污染。 适用的无血清培养基：基础培养液加添加成分，如 IMDM、Han’s F12。

39 6.4.3 单克隆抗体的大量制备 2. 体内培养制备单克隆抗体 从腹水中制备单克隆抗体也是实验室常用方法之
单克隆抗体的大量制备 2.  体内培养制备单克隆抗体 从腹水中制备单克隆抗体也是实验室常用方法之 一。在动物体内制备单抗，可在短时间内获得足够 量的单抗供实验使用，但要消耗大量活的小鼠而不 适合规模生产。另动物本身 的抗体给单抗的纯化 带来困难。 注射异十八烷基和不完全弗氏佐剂抑制小鼠免疫 功能。将杂交瘤接种于小鼠腹腔，诱导产生腹水， 分泌单抗。每只小鼠可获1~10ml腹水，常常5~6ml 腹水。单抗1~25μg ∕ ml。

40 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 鼠源性单抗在生命科学和医学临床方面应用前景很 广。但鼠源性单抗带有鼠抗原决定簇，其应用有一定的
人源性单克隆抗体制备及其发展 鼠源性单抗在生命科学和医学临床方面应用前景很 广。但鼠源性单抗带有鼠抗原决定簇，其应用有一定的 局限性：注入人体内引起抗鼠反应、抗体被清除、产生 过敏反应、不能有效激发机体的免疫防御系统。因此， 低免疫原性、高效性、人源性单抗是必须的。 1984年开始改造鼠源性单抗，使其人源化，1989年进 入了新阶段。但进展慢：缺乏融合率高、性状稳定的亲 本细胞，不能用任意抗原免疫人体获得足够的抗原特异 性B细胞。

41 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 人们致力于：培养筛选人源性融合亲本细胞系、 EBV病毒转化人B细胞、人源性轻链和重链可变区基
人源性单克隆抗体制备及其发展 人们致力于：培养筛选人源性融合亲本细胞系、 EBV病毒转化人B细胞、人源性轻链和重链可变区基 因转染细胞、噬菌体抗体库制备人单抗。

42 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 1、EBV的特征
人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 1、EBV的特征 Epistein和Bar（1964年）从非洲Burkitt淋巴细胞瘤中 建立的类淋巴母细胞株中首先发现类似于包疹病毒的病 毒颗粒（viron）EBV。含双链DNA病毒，只感染灵长类 动物B淋巴细胞，将其转化获永生能力。静止B淋巴细 胞最敏感，随着B淋巴细胞向浆细胞成熟，感染力逐渐 下降。

43 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 2. EVB制备 实验室常用B95-8细胞生产EVB。非洲绒猴外周单
人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 2. EVB制备 实验室常用B95-8细胞生产EVB。非洲绒猴外周单 核细胞感染野生型EVB（传染性单核细胞增多症患者 中分离），建系成为B95-8细胞株。 一般有10%~ 20%的感染细胞释放出完整的病毒颗 粒。 诱导剂：正丁酸、巴豆油、溴脱氧尿苷、碘脱氧尿 苷可激活细胞，感染、释放病毒的细胞增加到80%， EVB产量提高。

44 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 3、转化 转化所用的B淋巴细胞来源：淋巴结、扁桃体、脐 带血、外周血。
人源性单克隆抗体制备及其发展 一、EB病毒转化技术 3、转化 转化所用的B淋巴细胞来源：淋巴结、扁桃体、脐 带血、外周血。 密度离心分离人单核细胞，加病毒液，细胞浓度为 107个细胞∕ml，温浴2~3h，弃上清液，培养1周左右 即可见到转化的淋巴细胞。 EBV转化的B细胞克隆的效力很低；抗体分泌能力 也不稳定；不分泌或分泌无关抗体的细胞很快增殖； 故应及时反复克隆阳性细胞。 加入饲养层细胞可促进B细胞生长。

45 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 1、人-鼠杂交瘤单克隆抗体
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 1、人-鼠杂交瘤单克隆抗体 人-鼠杂交瘤的制备方法基本与鼠-鼠杂交瘤相同。 亲本骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞（例如p3∕X63- Ag8.653、NS-1、SP2 ∕ 0）和大鼠骨髓瘤细胞(如Y3Ag 1.2.3)。 亲本B细胞：人外周血、淋巴结、脾细胞。 人-鼠杂交瘤分泌单克隆抗体很不稳定，会很快失去 分泌单抗的能力。原因可能是人染色体丢失。

46 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 2、人-人杂交瘤单克隆抗体 人骨髓瘤细胞与人淋巴细胞融合。
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 2、人-人杂交瘤单克隆抗体 人骨髓瘤细胞与人淋巴细胞融合。 研究结果表明：人-人杂交瘤核型稳定，但亲本细 胞系种类非常有限。人类只能从骨髓瘤患者中培养筛 选建立细胞株。许多科学家做了大量工作，目前也只 有三大类（骨髓瘤细胞系、B淋巴母细胞系、淋巴瘤 细胞）共三十多株细胞可用。淋巴瘤细胞融合率低、 抗体分泌少。现常用的是EBV转化的B细胞筛选的淋 巴母细胞系 。

47 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 3、EBV转化-融合技术
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 3、EBV转化-融合技术 EBV转化的不足：效率低、克隆困难、抗体分泌不 稳定、产量低。长处：转化后的B细胞有无限的分裂 能力。融合制备杂交瘤的不足：融合率和抗体产量不 高。故同时应用转化和融合技术，综合两种技术的优 点：转化了的分泌特异抗体的细胞在体外长期存活， 反复融合，直至出现分泌特异抗体的杂交瘤止；融合 频率高（10-5）；抗体的特异性稳定；产量高。

48 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 3、EBV转化-融合技术：例如，Kozbor等（1982）：
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 3、EBV转化-融合技术：例如，Kozbor等（1982）： （1）转化人淋巴细胞B-6：分泌抗破伤风类毒素的抗 体，对乌本苷敏感。 （2）小鼠浆细胞瘤：p3∕X63-Ag8.653，不分泌抗 体，对HAT敏感。 （3）HAT培养基：含有乌本苷（ouabain）10-5 M。 （4）融合的杂交瘤细胞能长期存活，而未融合的死 亡。

49 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 4、转基因动物制备单克隆抗体
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 4、转基因动物制备单克隆抗体 人的抗体基因经改造后导入小鼠胚胎，得到的转基因小鼠免疫 后能产生人抗体。这种改造过的抗体绝大部分是人源性的，只有 构成抗原识别与抗原结合部位的轻、重链各三个互补决定区是鼠 源性的。 构建转人免疫球蛋白基因小鼠，制备人单抗，是解决人体内致 敏受限问题的一条新途径。转人免疫球蛋白基因动物：可用任何 抗原免疫而不受医学伦理学限制；可从血清中直接纯化人源性抗 体；可获得含人抗体基因的B淋巴细胞，制备基因工程抗体。具重 要的科研和商业价值，应用前景很广。

50 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 5、严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：
人源性单克隆抗体制备及其发展 二、细胞工程单克隆抗体技术 5、严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体： 严重免疫缺陷小鼠：severe combined immunodeficient mice (SCID mice)，纯系小鼠16号染色体突变，破坏了免疫球蛋白基因和T细胞 受体基因重组，动物B、T淋巴细胞功能有障碍导致联合免疫缺陷。 SCID mice可接受人体组织或器官移植，产生人—鼠嵌合体小鼠 （Hu - SCID mice）。移植人免疫干细胞到SCIDmice体内，用任何 抗原免疫SCID mice，可从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性B淋巴 细胞，进而细胞融合（或制备抗体库）。

51 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 利用细胞工程制备人单抗发展缓慢，技术路线都不完
人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 利用细胞工程制备人单抗发展缓慢，技术路线都不完 善。其主要原因：适合于融合的亲本细胞系缺乏；不能 任意抗原免疫人体；不能随意从人体中分离淋巴细胞； 杂交瘤融合频率低；抗体分泌稳定性差等。 鼠源性抗体有其固有的局限性。 科学工作者结合分子生物学技术制备人源性单：人 – 鼠嵌合抗体、改型抗体、组合抗体库、噬菌体抗体库技 术、表位印迹选择技术等。

52 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 1、人 –鼠嵌合抗体： 抗体Fc区的主要功能：激活机体免疫反应；产生人抗
人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 1、人 –鼠嵌合抗体： 抗体Fc区的主要功能：激活机体免疫反应；产生人抗 鼠反应。编码人抗体Fc 区的DNA片段代替鼠源性Fc段 DNA，生产人 –鼠嵌合抗体：人源性抗体的一部分（Fc 区）代替鼠源性抗体的一部分，保留其对抗原的特异 性，具有与补体和细胞结合的功能，减少异源性蛋白的 抗原性（人抗鼠反应）。 嵌合抗体由人稳定区和鼠可变区组成，虽大大降低了 人抗鼠免疫反应，但仍具一定的免疫原性。

53 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 2、改型抗体： 也称CDR移植抗体。鼠源抗体中与抗原结合的三个
人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 2、改型抗体： 也称CDR移植抗体。鼠源抗体中与抗原结合的三个 互补决定区（CDR）基因置换人抗体中相应部分，所 得抗体只有CDR区来自小鼠，在人体内的免疫反应大 大降低。 但技术复杂，制备困难，进展很小。

54 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 3、组合抗体库与噬菌体抗体库技术：
人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 3、组合抗体库与噬菌体抗体库技术： 省去了细胞融合，直接从表达的表型中筛选抗体基 因型。 B淋巴细胞（人、鼠）中分离mRNA逆转录成cDNA 经PCR扩增轻链和重链cDNA，用限制性内切酶酶切 cDNA，克隆到噬菌体载体中与噬菌体蛋白Ⅲ基因连成 融合基因，由辅助噬菌体感染E. coli， E. coli则携带有 表达载体，会释放噬菌体——外壳带有抗体片段，筛 选出（如免疫亲和层析法）特异性抗体。

55 6.4.4 人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 4、表位印模选择技术： 上述筛选常常只能鉴别出高亲和力的抗体，亲和力
人源性单克隆抗体制备及其发展 三、人单抗制备技术的发展 4、表位印模选择技术： 上述筛选常常只能鉴别出高亲和力的抗体，亲和力 较低的抗体一般难以从未免疫的噬菌体抗体文库技术 中分离出来。 表位印模选择技术：用特定已知抗原从抗体组合文库（或噬菌体抗体文库）中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源性基因与人源性基因置换、匹配，获得人源性抗体。将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到SP2∕O细胞中，产生人单克隆抗体。

56 6.4.5 单克隆抗体的应用 目前，单克隆抗体已广泛应用于生命科学领域的各 个学科中。用于医学上诊断和治疗传染病、肿瘤以及
单克隆抗体的应用 目前，单克隆抗体已广泛应用于生命科学领域的各 个学科中。用于医学上诊断和治疗传染病、肿瘤以及 其他疾病；用于免疫学中的抗原的研究；用于生物蛋 白质大分子的分离和纯化。 已在农业、生物、制药、医疗等领域得到越来越 广泛的应用。

57 6.4.5 单克隆抗体的应用 1、单克隆抗体在医学上的应用 （1）单克隆抗体靶向制剂：将纤溶酶原激活剂偶
单克隆抗体的应用 1、单克隆抗体在医学上的应用 （1）单克隆抗体靶向制剂：将纤溶酶原激活剂偶 联到抗纤维蛋白克隆抗体上，在实验动物模型体系 中，该分子复合物与血凝块结合，在血液中纤维蛋白 原尚未明显减少时就已将血凝块溶解了。该分子复合 物称为单克隆抗体靶向制剂。 （2）在肿瘤诊断与治疗中的应用：单克隆抗体用 于肿瘤定位显像诊断方面已取得良好的结果；在治疗 上的应用就远不如在诊断上所取得的成果。 （3）其他临床诊断及治疗：现已有商品的单抗试剂 盒出售，可对一些过敏源、癌症、性病、妊娠、妇女 月经排卵等进行早期诊断。

58 6.4.5 单克隆抗体的应用 2.免疫学研究 单抗在免疫学上：可鉴定、区分各种抗原；可详 细检测大分子抗原上不同的抗原决定簇；鉴定各
单克隆抗体的应用 2.免疫学研究 单抗在免疫学上：可鉴定、区分各种抗原；可详 细检测大分子抗原上不同的抗原决定簇；鉴定各 种组织之间的相容性；寻找与肿瘤或其他细胞表 面抗原结合的优良试剂等。 3.大分子蛋白的提纯 利用免疫亲和层析柱提纯的干扰素IFN-α，在 其实浓度低于0.02%的情况下，回收率可达到 97%。