HPLC 色谱柱选择与方法开发.

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1 HPLC 色谱柱选择与方法开发

2 概要 固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具

3 概要 固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具

4 选择性因素 分离度 Rs= (1/4) (a-1)  N [k/1+k] a= 选择性 N= 柱效 k= 容量因子 选择性是最重要的因素!

5 选择性因素 通过改变以下一点或几点来改善选择性: 温度 流动相 固定相 pH
Temperature generally decreases the run time and changes the viscosity of the mobile phase, therefore changing backpressure.

6 温度 通常缩短保留时间 注意: 柱温限制 分析物温度限制

7 流动相 总则: 选择在分析物pKa +/- 2 pH的缓冲液 100%水相条件能改善极性保留(使用可在100%水相条件下使用的色谱柱)
等度 vs. 梯度

8 水相稳定性 几乎没有变化 色谱柱稳定

9 固定相选择性 疏水性 极性选择性 芳香选择性

10 疏水性 固定相的保留强度 通常用丁基苯的k值（容量因子）测量

11 疏水性 考虑: 键合相特性 (C18, C8, Phenyl, 等) 表面积 (m2/g) 键合相密度 (umol/m2) I

12 疏水性 C18 phases C8 phase 300Å C18 phase I

13 疏水性 传统的色谱法使用 C18 好处: 亚甲基选择性 最佳的疏水选择性
Longer: ex. C30 has higher carbon chain but low bonding density (due to steric hindrance) Long: ex. C18 has high carbon chain and high bonding density Shorter: ex. C8 has smaller carbon chain and higher bonding density

14 疏水性 传统的色谱法使用 C18 缺点: 较长的保留时间 可能不保留极性化合物

15 极性选择性 下面两者之间的相互作用: 固定相的极性基团 分析物的极性官能团

16 极性选择性 提高极性选择性 极性端基封尾基团 极性镶嵌基团 苯基固定相
Polar Endcapping, adding a polar group to the silica surface so that surface can “wet” to use more aqueous mobile phase for hydrophillic interactions Polar Embedded groups- generally within the ligand Phenyl stationary phases will increase the polarity of the stationary phase

17 极性选择性 色谱柱: Luna™ 5m C18(2) YMC-Pack™ Pro C18
Synergi™ 4m Polar-RP (醚连接的苯基柱) x4.6mm 流动相: 75:25 甲醇 : 水 流速: mL/min 组分: Estrone 2. Estradiol Polar-RP… many polar interactions----(Phenyl, polar endcapping, polar embedded group)

18 极性选择性 1+2 1 2 Luna™ C18(2) YMC-Pack™ Pro C18
Synergi™ Polar-RP™ YMC-Pack™ Pro C18 1+2 1 2 Polar-RP… many polar interactions----(Phenyl, polar endcapping, polar embedded group)

19 芳香选择性 苯基基团 较少疏水保留 使用甲醇可增大选择性 通常 C3 + 苯基基团 利用芳香环的作用
Less hydrophobic retention- usually a short carbon chain and then phenyl group---C2, C3 or C6

20 芳香选择性 色谱柱: Luna™ 5m C18(2) 150x4.6mm Luna™5m Phenyl-Hexyl 150x4.6mm
Synergi™ 4mm Polar-RP150x4.6mm 流动相: 50:50 乙腈 : 20mM 磷酸钾 pH 2.5 流速: 1.0 mL/min 组分: 酸性的, 芳香化合物 Indoprofen 2. Ethyl paraben 3. Naproxen 4. Diflunisal Indomethacin 6. Ibuprofen Less hydrophobic retention- usually a short carbon chain and then phenyl group---C2, C3 or C6

21 芳香选择性 C18(2) Phenyl-Hexyl Polar-RP
Increased hydrophobic retention with Phenyl-Hexyl compared to polar-RP More polar resolution with the polar rp than pheny-hexyl Reversed elution order for late eluting compounds with both phenyl phases Notice co-eluting peaks on C18 for polar compounds

22 pH 对选择性的影响 pH 1 – 12 稳定性

23 pH 对选择性的影响

24 pH 对选择性的影响

25 pH 对选择性的影响

26 固定相选择性 C18 相 苯基相

27 概要 固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具

28 Synergi™ Hydro-RP 极高的疏水性保留 极性端基封尾，100% 水相稳定 改善极性选择性

29 Synergi™ Hydro-RP Synergi Hydro-RP VS. Luna C18(2)

30 Luna™ C18(2) 已证实的可靠的 C18 色谱柱 极低硅醇活性 重现性高

31 Synergi™ Max-RP 疏水性与 C18相似 – 但这是 C12 比多数C18高25%的游离硅醇覆盖率 碱性化合物获得更尖锐峰形

32 Synergi™ Max-RP 中性pH下的碱性药物

33 另一新的产品 (Gemini™ C18)

34 Gemini™ C18 Application at pH 10.5

35 Luna™ C8(2) & C5 降低疏水保留 缩短运行时间

36 Luna™ Phenyl-Hexyl 疏水 & 芳香选择性 低 LC/MS 流失 可再生的 & pH 稳定的苯基相

37 Synergi™ Fusion-RP 改善极性选择性,同时减少运行时间 极低 LC/MS 流失 100% 水相稳定

38 Synergi™ Fusion-RP Synergi Fusion-RP 4 80Å 典型的C18 极性保留时间更长 疏水保留时间更短
min 2 4 6 8 10 12 14 mAU 100 200 300 400 500 VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\TEST0034.D) 50 150 250 350 VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:\HPCHEM\1\DATA\SW1003\FUSI0046.D) 极性保留时间更长 疏水保留时间更短 典型的C18 运行条件 流动相: : mM 磷酸钾 pH 2.5 : 乙腈 流速: 1.5 ml/min 柱温: 室温 检测: 210nm 样品: 1. 马来酸 2. 氯苯那敏 3. 曲普利啶 4. 苯海拉明

39 Synergi™ Polar-RP 极性 & 芳香保留 100% 水相稳定 改善极性选择性

40 Luna™SCX 含胺和聚胺化合物 咳嗽和感冒药物 吗啡和滥用药物 核苷，多肽和多肽图

41 概要 固定相选择性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具

42 方法开发工具 疏水性级别 吸附剂特性 & 应用 固定相描述 & 色谱柱特点

43 方法开发工具

44 方法开发工具 技术支持队伍 问题解答指南 Advanza讨论会 产品讨论会 方法开发讨论会

45 总结 固定相选择性 考虑固定相和化合物的疏水性、极性和芳香性 色谱柱选择性的实际应用 方法开发工具

46 谢谢 Trademarks Xterra® is a registered trademark of Waters Corporation
YMC-Pack™ Pro C18 is a registered trademark of YMC, Inc. Synergi™ , Gemini™, and Luna™ are trademarks of Phenomenex, Inc. Phenomenex is not associated in any way with Waters Corporation or YMC. Copyright © 2005 Phenomenex Inc., all rights reserved.