毛细管气相色谱法测定野菊花挥发油中 龙脑和樟脑的含量

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1 毛细管气相色谱法测定野菊花挥发油中 龙脑和樟脑的含量
一、实验目的 二、实验原理 三、CP-3800型气相色谱仪 四、实验步骤 五、数据处理 六、思考题 复旦化学系 教学实验中心 包慧敏 教学手段：讨论、提问 同学生一起回顾本学期做过的其他仪分实验，类比、过渡到本次实验； 重点类比紫外-可见分光光度法(普化实验涉及、本学期会再做到)，以实验名称中的关键词“分子”、“荧光”、“面粉”、“核黄素”等为主线，提问实验原理、步骤等。 11:50:40

2 一、实验目的 1、掌握中药挥发油的水蒸馏同时溶剂萃取的方法 2、熟悉毛细管气相色谱仪的工作原理及其操作
3、掌握龙脑、樟脑GC分析及内标标准曲线法定量的方法 11:50:40

3 二、实验原理 色谱、色谱图、色谱分析法、 定性分析、定量分析、定量校准方法 11:50:40

4 色谱法分类 毛细管气相色谱 一、按分离原理：依据物理或物理化学性质 吸附色谱 分配色谱 离子色谱(IC)
排阻色谱(SEC) 络合色谱和亲和色谱 二、按分离介质的几何形状 柱色谱 平面色谱 三、按流动相的物理状态 气相色谱(GC) 液相色谱(LC) 超临界流体色谱(SFC) 毛细管气相色谱 2 北大-分析化学教程-李克安 一、按分离原理：依据物理或物理化学性质 吸附色谱——包括气固色谱(GSG)和液固色谱(LSG)； 分配色谱——有气液色谱(GLC)和液液色谱(LLC)； 离子色谱(IC)——有离子交换色谱、离子排斥色谱和离子对色谱； 排阻色谱(SEC)——包括凝胶渗透色谱(GPC)和凝胶过滤色谱(GFC)； 络合色谱和亲和色谱。 需要指出，大部分色谱过程并不是仅有一种分离机理起作用，而是多种机理共同作用的结果，上述分类只是基于被分析物与固定相和流动相的主要相互作用。 补充：1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography )利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。 2.分配色谱法 ( partition chromatography )利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 二、按分离介质的几何形状 柱色谱——气相色谱(GC)和柱液相色谱(LC) 平面色谱——薄层色谱(TLC)和纸色谱(PC) 按照色谱柱的类型又可以分为填充柱色谱和开管柱色谱，柱液相色谱(LC)按照发展过程分为经典液相色谱和现代（高效）液相色谱(HPLC)。 补充： 1.柱色谱法 (column chromatography)：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。2.纸色谱法（paper chromatography）纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。3.薄层色谱法 (thin-layer chromatography, TLC)：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 三、按流动相的物理状态 气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、超临界流体色谱(SFC) 应当指出，电泳也是一种分离分析方法，特别是过去20多年来飞速发展的毛细管电泳(CE)。尽管分离机理上电泳与色谱常常不同，但两者密切关联。比如胶束电动色谱(MEKC)、微乳电动色谱(MEEKC)和毛细管电色谱(CEC)，就是色谱与电泳相结合的产物。所以，习惯上人们将色谱和电泳看做是同一类分析技术 北大-分析化学教程-李克安 11:50:40

5 色谱定性分析 ——利用保留值进行定性 （1） 标准物质对照定性 tR1′ （2） 相对保留值对照定性
（2） 相对保留值对照定性　 　　　　　r1,2 = tR1′/tR2′= k1/k2 r 值可以是文献的或测定的 （3） 利用文献进行定性 P433 　　　　　保留指数 I（Kováts指数） ● N+1, N 相邻的正构烷烃 ● 与文献对照，不需要纯物质 保留指数仅与固定相的性质、柱温有关，因此，同一物质在不同性质固定相上的保留指数之差，可以反映固定相的分离特征。用柯瓦指数确定气相色谱的相对保留值的方法，已推广到高效液相色谱法中，这时使用正构烷基苯作为标准化合物。 　保留指数 I（Kováts指数） Ix={(logZx-logZN)/ (logZN+1-logZN)} ×100＋100N 技巧：关于保留指数在气相色谱中~~~，需要用到的请翻阅课本，在这里我们就不做详细介绍了。 8.6.3 北大-分析化学教程-李克安 色谱定性分析方法　p282 所谓定性分析就是鉴定色谱峰的归属和色谱峰的纯度（有无共流出峰）。常用方法有： 1、标准物质对照定性 就是在相同的色谱条件下，分别对标准样品和实际样品进行分析，对照保留值即可确定色谱峰的归属。GC多用保留时间、相对保留时间、或保留指数；HPLC多用保留时间、相对保留时间。问题是有些标准物质不容易得到，而在样品组分大部分或全部未知的情况下，选什么样的标准物质对照就更加困难了。所以，标准物质对照定性虽然最直接，但并不总是容易的。 2、利用文献数据定性 前人已经发表的文献中有大量的数据可供参考，比如GC保留数据库收集了千种化合物在不同色谱柱上的保留指数，如果采用文献相同规格的色谱柱和分析条件，就可以重现文献数据。因此，可将测得的保留指数与文献值相比较，从而达到定性鉴定的目的。 在HPLC中，因为色谱柱填料的重现性不及GC柱的重现性好，故较少使用文献数据。即使利用文献数据，一般也要结合标准样品对照。 3、利用选择性检测器定性 4、在线联用仪器定性 5、其他定性方法 11:50:40

6 色谱定量分析 定量关系式： W = f·A 或 A = S·W 1．峰面积或峰高的测量 2．定量校正因子 3．定量校准方法：
外标法、内标法、归一化法 S - 检测器的响应灵敏度 同一物质在不同检测器上灵敏度不同 8.6.4 北大-分析化学教程-李克安 色谱定量分析方法 在检测器的线性范围内，响应值（峰面积或峰高）与样品浓度呈正比，这是色谱定量分析的基础。 1、峰面积或峰高的测量 2、定量校正因子 3、常用定量计算方法（见后面的PP注） 11:50:40

7 标准曲线法 外标法 v.s. 内标法 1.系列标准溶液绘制工作曲线； 2.测定未知溶液，查得其浓度。 标准曲线法求解K ： 图解法、解析法
外标法不同于归一化法，它对进样体积的要求非常严格，一定要很准确，这样才能得到较好的定量依据。 归一化法测得的是百分含量 不同仪器得到的工作曲线是不一样的，在做实验的时候，要使结果准确，还要对工作曲线进行及时的校正 内标法 v.s. 外标法 同:可以单点校正、也可以多点校正；只要求待测组分出峰且分离完全，其余组分可快速放空缩短分析时间。 不同:内标法的定量精度最高，它是对内标物做相对校准，内标物要分别加到标准样品和未知样品中。抵消由于色谱条件（包括进样量、操作条件等）的波动带来的误差。不必测出校正因子，也不需严格定量进样 马老师：结合第二章相对信号、校准模式讲解内标、外标、归一化。 内标标准曲线法： 以 s 的同样量加入到 i 系列标准溶液中，测定 As、Ai 以 ~ ci 作图，得内标标准曲线，查得未知样中i 的含量 此法不必测出校正因子，也不需严格定量进样。 （进样量变化以及实验条件变化而引起的误差由测得的相对峰面积 而抵消 ） 内标物须满足：① 试样中不含该物质；② 内标物色谱峰的位置应在各待测组分之间或与之相近；③ 与试样能互溶并无化学反应；④ 内标物浓度恰当，峰面积不应与待测分相差太大 要选择一个合适的内标物不是一件容易的事情。理想的内标物是样品中不存在的组分，其保留时间和响应因子应该与待测物尽可能接近，且要完全分离。此外，内标法定量时，样品制备过程要多加一个定量加入内标的步骤，标准品和未知样都要加入一定量的内标。 内标法的定量精度最高，因为它是相对于标准物（叫内标物）的响应值来定量的，而内标物要分别加到标准样品和未知样品中。这样就可抵消由于操作条件（包括进样量）的波动带来的误差。(不必测出校正因子，也不需严格定量进样) 与外标法类似，内标法只要求待测组分出峰且分离完全即可，其余组分则可用快速升高柱温使其流出或用反吹法将其放空，这样就可以达到缩短分析时间的目的。 外标标准曲线法： 峰面积Ai ~ 被测纯样品浓度 ci 作图，得到标准曲线。 在相同色谱条件下，测得未知试样中该组分的峰面积，在标准曲线上即可求得未知试样中该组分的浓度。 标准曲线法比较简单，不需要已知校正因子。但必须要求：进样量准确，分析过程中实验条件一致，以及标准曲线体系与待测试样体系相似。 该法简单，是色谱分析中采用最频繁的方法，只要用一系列浓度的标准样品作出标准曲线及其回归方程（fi为斜率），就可以在完全一致的条件下对未知样品进行定量分析。只需要待测组分可出峰且分离完全，而不考虑其他组分是否出峰是否分离完全。 需要强调，外标法定量时，分析条件必须严格重现，特别是进样量。如果测定未知物和测定校准曲线时的条件有所不同，就会导致较大的定量误差。校准曲线可能不过原点，此时回归方程为：ci=FiAi+C 分析过程中实验条件一致，以及标准曲线体系与待测试样体系相似。 11:50:40

8 归一化法 气相色谱中，把所有出峰组分含量之和以百分之百计算的定量分析方法 要求：1、样品中所有组分都能从色谱柱流出来并被检测到
2、各个组分的含量不能相差太大 归一化法定量特点：简单、方便，其结果与进样量无关，仪器条件稍有变化对结果影响不大 在FID上，各种烃类的相对质量校正因子都很相近，混合芳烃中各组分的百分含量近似等同于面积的百分含量 11:50:40

9 定量分析方法 系列标样比单个标样更准确 ① 外标法 单个标样——直接比较法（标准对照法） 系列标样——标准曲线法（工作曲线法）
注意点：1. 单个标样时 cs 应与 cx 值接近；系列标样时 cx 值应处于系列溶液浓度中间 2. 用于较简单试样体系 ② 标准加入法 单个标样加入——标准加入法 系列标样加入——系列标准加入法（连续标准加入法） 注意点：1. 标准样cs 的确定: cs≥100 cx ，Vs≤V/100 保持各浓度在同一数量级，基体相似 2. 用于复杂试样体系，或试样量少时 11:50:40

10 定量分析的校准方式 1. 外校准模式 独立测量标准系列 (单点，多点) 标准加入法 内校准模式
1. 外校准模式 独立测量标准系列 (单点，多点) 校准体系与待测体系相同或基本相同 标准加入法 内校准模式 实验条件难以完全重复——减少实验条件变化造成的误差 同一次测量中，测定相对信号（待测组分信号与内标组分信号的相对强度） 待测样品和校准体系中加入一定量的某种内标物——内标法（单点校正或多点校正）合适的内标物 ~ 合适的信号 11:50:40

11 三、CP-3800型气相色谱仪 11:50:40

12 载气系统、进样系统、柱系统、检测系统、数据处理系统
气相色谱仪 载气系统、进样系统、柱系统、检测系统、数据处理系统 11:50:40

13 柱系统 毛细管柱：填充柱、开管柱（涂渍方法不同 ） 毛细管柱 (1) Varian Capillary Column CP-Sil5CB
15m 0.25mm 0.25um #CP8510 (2) HP.5 Crosslinked 5% Ph Me Silicone 25m×0.32mm ×0.52um film thickness 11:50:40

14 载气系统 载气：氮气0.5MPa， 流速1ml/min，分流比 20:1 检测器：FID， 氢气0.3MPa，空气0.4MPa，
氢气/氮气流量比 1:1~1:1.5， 氢气/空气流量比1:10 11:50:40

15 气相色谱的检测器 11:50:40

16 温控系统 包括进样系统、柱箱、检测器、辅助部分 本实验中文件xxx.mth参数设定: Method 22min
(1)Injector-Middle Injector: 250℃； (2)Colum Oven: 60℃,1min; 60~280℃,12℃/min,3min; (3)Detector-Middle Detector: FID,300 ℃ 柱温选择的一般原则是：在确保难分离组分有尽可能好的分离的前提下，选择尽可能低的柱温，但以保留时间事宜且色谱峰不拖尾为度。 程序升温利于低沸点组分的分离，而且还可以缩短分析时间，峰形也好。 11:50:40

17 四、实 验 步 骤 1、水蒸馏和微波法同时溶剂萃取法提取野菊花挥发油 2、测定樟脑、龙脑的标准曲线 3、野菊花中龙脑、樟脑的含量测定
1、水蒸馏和微波法同时溶剂萃取法提取野菊花挥发油 2、测定樟脑、龙脑的标准曲线 3、野菊花中龙脑、樟脑的含量测定 11:50:40

18 中药野菊花挥发油中的活性成分及提取方法 野菊花挥发油中活性成分提取 樟脑、龙脑、癸烷的结构、性质 水蒸馏同时溶剂萃取装置
樟脑是一类脂环状的酮类化合物，在医学上常用作呼吸循环兴奋药等。 龙脑俗称冰片，又称樟醇。 水蒸馏同时溶剂萃取装置 11:50:40

19 CP-3800型气相色谱仪得到的野菊花挥发油的GC-FID色谱图
五、 数据采集和处理 CP-3800型气相色谱仪得到的野菊花挥发油的GC-FID色谱图 11:50:40

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23 六、思考题 1、填充柱色谱与毛细管色谱的比较 2、内标法与外标法定量的优点和缺点 3、色谱定性的优点和缺点, 如何克服它的缺点
4、气相色谱的适用范围，即什么样品或对象适合用气相色谱检测？ 5、选择固定液的规律或原则？被分析的组分的流出规律是什么？ 11:50:40

24 备注：意外状况及处理 1、ignit面板控制 2、氢气的检查 11:50:40