第二十章 毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis,CE

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1 第二十章 毛细管电泳法 Capillary Electrophoresis,CE
第一节 毛细管电泳的特点和分类 第二节 毛细管电泳理论 第三节 毛细管电泳的主要分离模式 第四节 毛细管电泳仪

2 高效毛细管电泳仪器（1）

3 高效毛细管电泳仪器（2）

4 高效毛细管电泳仪器（3）

5 概 述 在电解质溶液中，位于电场中的带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。 1.经典电泳分离法的不足 所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。 图 20－1

6 2.高效毛细管电泳技术上的重要突破 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管；
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减 小了温度效应，使电场电压可以很高； 二是采用了高达数千伏的电压。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小， 柱长增加； 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论 塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 毛细管电泳法：是在散热效率很高的毛细管内进行的 电 泳，可以应用高电压，极大改善了分离效果。

7 3 毛细管电泳的特点 电泳与色谱 分离原理不同 分离过程相同 流程相同

8 1 分离原理： 电泳―带电粒子在一定介质中因电场作用而发生定向运动，因粒子所带的电荷数、形状、离解度等不同，有不同的迁移速度而不同。 色谱―不同组分在两相中的分配系数不同而分离。 2 分离过程： 差速迁移过程。名词、概念、基本理论均适用。 3 仪器流程： 进样、分离、检测、数据处理。

9 毛细管电泳的特点 高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。
高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 仪器简单，操作成本低，污染小：分析一个试样仅需几毫升流动液 应用广泛

10 第一节 毛细管电泳理论 一、电渗和电渗率 电渗 —— 是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
电渗的形成：石英毛细管内壁表面硅羟基在缓冲溶液中发生电离，带负电，并吸引溶液中的阳离子，形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的阳离子向阴极运动。并携带溶液整体向负极移动，形成电渗流。 电渗流：液体的整体流动。uos=μos E E为电场强度。 μos电渗率，μos=ε ξos /η 方 向：阳极→阴极。

11 二、电泳和电泳淌度 uep=μepE E为电场强度。 μep=εξi /4πη
粘度 介电常数 Zeta电势 粒子表面带电荷大，质量小，Zeta电势大。 带电粒子可按照表面电荷密度的差别，以不同速度在电介质中移动，而实现分离。

12 离子活度系数、溶质分子的离解程度对粒子的 淌度有影响——有效淌度：
离子活度系数、溶质分子的离解程度对粒子的 　淌度有影响——有效淌度： μef ＝ Σαiγiμep 分子的第i 级电离度 活度系数 荷电粒子在电场中的迁移速度，与电场强度 、介质特性、离解度、电荷数及其大小、形 状有关。

13 电泳现象与电渗流现象 电泳现象： 带电粒子在电场作用下的迁移。
电泳现象： 带电粒子在电场作用下的迁移。 电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基, pH>2时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向阴极移动。 电渗流的速度是电泳速度的5～7倍。 图 20－2

14 三、表观淌度和权均淌度 阴离子 μapp ＝μos－μep 中性分子 μapp ＝ μos uapp ＝μapp E
中性分子不能分离。 表观迁移速度：uapp 粒子的实际迁移速度 uapp ＝μapp E 出峰顺序：阳离子——中性物质——阴离子

15 综上所述： 毛细管电泳：当试样引入毛细管后，带电粒子在电场作用下，各向电性相反的电极做泳动。若电渗淌度在数值上大于缓冲溶液中所有向阳极泳动的阴离子的电泳淌度，那么所有离子型和非离子型物质都被电渗流携带而向负极运动，从毛细管的一端依次洗脱出来，因迁移速度的不同而实现分离。

16 四、分离效率和谱带展宽 速率方程 H＝ 2D/u 只有纵向扩散项 （一）理论塔板数和塔板高度 n＝5.54(tm/W1/2)2 H＝Ld/n
Ld：进样口至检测器之间的距离；tm：迁移时间 （二）谱带展宽 源于溶液、溶质自身：自热、扩散和吸附。 源于系统：进样、检测。 速率方程 H＝ 2D/u 只有纵向扩散项 自热：径向温度梯度 径向粘度梯度 迁移速度径向 差异 区带展宽。 扩散：纵向扩散，分子量大扩散小。 吸附：溶质中的阳离子与带负电的管壁离子作用、疏水 作用。表面积与体积比（内径细）吸附作用大。

17 五、分离度

18 第二节 毛细管电泳的主要分离模式 1 按填充物形状：自由溶液 非自由溶液 2 按机制： 电泳型、色谱型、电泳/色谱型
2 按机制： 电泳型、色谱型、电泳/色谱型 3 常用分离模式：毛细管区带电泳、毛细管凝胶 电泳、胶束电动毛细管色谱、微乳液电动毛细管 色谱、毛细管电色谱、毛细管等电聚焦、非水毛细管电泳。

19 一、毛细管区带电泳（CZE） 最普遍、最基本的 一种分离模式。 图 20－3

20 分离原理：样品组分之间荷质比的差异，造成组分迁移速度不同。
条件： 分离电压：电压高，速度快。最佳电压。 缓冲溶液 ： 缓冲容量大；在检测波长有较低吸收；淌度小，电流小； 缓冲溶液浓度：浓度大，离子强度大，减少组分与管壁、组分间的作用力。电流增大，产生热量大。 pH值：pH值>或< 分析组分等电点 1个单位。 酸性组分－－碱性介质，碱性组分－－酸性介质， 5 添加剂：改善分离

21 二、胶束电动毛细管色谱（MEKC） 在缓冲溶液中加入表面活性剂，形成一疏水内核、外部带正或负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且u电渗流 > u电泳 ，则带电的胶束以一定的速度向负极方向移动，中性试样分子在随电渗移动的同时，在胶束相和溶液（水相）两相间分配，各组分的分配系数的差异造成分离。 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 图 20－4

22 三、 毛细管凝胶电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。
毛细管电泳 ＋ 凝胶电泳 能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。

23 四、 毛细管电色谱（CEC） 包含了电泳和色谱两种机制，根据被分离组分在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度差异而达到分离。 电泳 ＋ 色谱 电泳淌度 分配系数 CEC结合了CE的高效和HPLC的高选择性。 固定相——正相、反相。 流动相—— 缓冲溶液和溶剂混合。

24 五、 非水毛细管电泳（NACE） 在有机溶剂为主要的非水体系中进行的毛细管电泳。 在有机溶剂中必须加入电解质，使之具有导电性。
优点：可分离水中难溶的试样；可承受高电压产生的高电场。

25 第四节 毛细管电泳仪 高压电源；毛细管柱；进样；检测

26 一、高压电源 电源、电极、电极槽。电压：0～30KV。
二、毛细管柱 化学和电惰性，有电渗，能透过紫外光。 石英毛细管：内径25～75μm，一般30cm，最长70cm 三、进样 电动进样：电迁移和电渗作用； 压力进样：压力差。 扩散进样：浓度差。 四、检测 紫外(UV) 激光诱导荧光检测器(LIF)， 可检测到：10-19～10-21 mol/L