免疫标记技术.

Presentation on theme: "免疫标记技术."— Presentation transcript:

1 免疫标记技术

2 第一节 免疫标记技术的基本概念 一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质

3 免疫标记与标记免疫 免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术 标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术

4 常用的免疫标记物质 类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定
类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化

5 第二节 酶标记技术 一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定

6 常用标记方法 1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法

7 戊二醛交联法 (一步法） 抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶

8 戊二醛交联法（二步法） COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶

9 过碘酸盐氧化法 NaIO4 酶-五炭糖环 + NH2抗体 NaBH4 H2O Schiff碱 O O O O OH O O O N N N

10 标记免疫物的分离与鉴定 1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析 2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度

11 第三节 荧光标记技术 一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化

12 常用标记方法 1、荧光素的概念 2、生物标记荧光素的要求 3、常用荧光素标记原理与方法

13 生物标记荧光素的要求 1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性
5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存

14 FITC的标记原理与方法 荧光素-N=C=S + NH2-抗体 荧光素-N-C-N-抗体 H S H

15 RB200的标记原理与方法 荧光素-SO3Na + PCl5 荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl
荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体 荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl

16 标记免疫物的分离与鉴定 1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析 2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义

17 第四节 放射性核素标记技术 一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化

18 常用标记方法 1、常用放射性核素 2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）

19 直接法（氯胺T法） OH -NHCHONH- CH2 OH -NHCHONH- CH2 氯胺T Na125I 。C 125I

20 间接法（连接法） CH2 OH O H-C-C-O-N-C-CH2 H O O=C-C-CH2 CH2 OH O
NSHPP 氯胺T 125I + Na125I

21 间接法（连接法） CH2 OH O H-C-C-O-N-C-CH2 H O O=C-C-CH2 OH 125I 125I + NH2-蛋白质
H-C-C-N-蛋白质 H O H

22 标记免疫物的分离与鉴定 1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析 2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性
比放射性（mCi/mg）应用意义

23 本章小结 1、免疫标记技术的概念 2、常用免疫标记物质及其标记方法 3、标记免疫物质的分离与鉴定

24 思考题 1、何谓免疫标记技术？ 2、常用的免疫标记物质有哪些？ 3、酶标记的主要方法有哪些？ 4、F/P比值的实用意义如何？
5、何谓比放射性？有何意义？

25 标记免疫技术的应用

26 第一节 标记免疫技术的分类 一、按指示标记物质划分的类型 二、按测定方式划分的类型 三、按测定用途划分的类型

27 按指示标记物质划分的类型 1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、发光免疫技术 5、金免疫技术

28 按测定方式划分的类型 1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）

29 均相型（homogenous） 非均相型（heterogeneous）

30 双标记均相荧光免疫测定

31 酶扩大免疫测定技术

32 按测定用途划分的类型 1、免疫测定技术 2、免疫组化技术

33 第二节 酶联免疫吸附试验 一、ELISA技术的原理与方法 二、 ELISA技术的操作注意要点

34 ELISA技术的原理与方法 间接法 夹心法 竞争法

35 间接法

36 夹心法

37 竞争法

38 酶标仪

39 酶标仪

40 ELISA技术的操作注意要点 试剂器材 操作环节 合适工作浓度

41 第三节 荧光抗体技术 一、荧光抗体技术的原理与方法 二、荧光抗体技术的操作注意要点

42 荧光抗体技术的原理与方法 直接法 间接法 补体法 双标记法

43 间接法 直接法 双标记法 补体法

44 荧光抗体技术的操作注意要点 标本处理 染色操作 结果观测

45 荧光显微镜

46 荧光显微镜使用原理 激发滤片（BG） 标本 吸收滤片（OG） FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm

47 吸收滤片 激发滤片 荧光滤镜使用原理

48 第四节 放射免疫测定技术 一、放射免疫测定技术的原理与方法 二、放射免疫测定技术的操作注意要点

49 结合相 游离相 放射免疫分析法的原理与方法

50 结合、游离相放射性含量比值 40 30 20 10 未标记抗原含量

51 β液闪仪

52 γ计数器

53 放射免疫测定技术的操作注意要点 反应的温度与时间 结合相与游离相的分离

54 免疫标记技术的比较 FIA ELISA RIA 敏感性 较低 高 高 特异性 高 高 高 重复性 差 好 好
敏感性 较低 高 高 特异性 高 高 高 重复性 差 好 好 检测对象 Ag/Ab Ag/Ab Ag

55 本章小结 1、标记免疫技术的类型 2、ELISA技术的原理与方法 3、荧光抗体技术的原理与方法 4、RIA技术的原理与方法

56 思考题 1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？ 2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？ 3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？