第二节 淋巴细胞的检测技术 一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法

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1 第二节 淋巴细胞的检测技术 一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法
(一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 > 90%)的分离 密度梯度离心法 (2000rpm,15min) (密度为1.077)

2 (二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法： 人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊红细胞(SRBC)  形成E花环  密度梯度离心，花环细胞沉降于管底  裂解SRBC  获纯化T细胞

3 T细胞亚群分离－花环试验

4 2.尼龙纤维分离法： 单个核细胞  通过尼龙纤维柱  B细胞和单核细胞(粘附特性) T细胞(非粘附性) 3.免疫荧光法： 单个核细胞 + 抗CD3(或CD4，CD8)McAb  +荧光素标记第二抗体  荧光显微镜下鉴定CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞

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6 4.流式细胞术（flow cytometry, FCM）：
荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过FACS分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter)

7 流式细胞仪

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9 5.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞  通过磁场  分离磁珠结合细胞  +解离剂  获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细 胞 + 抗体  通过磁场  分离磁珠结合细胞  +解离剂  获纯化细胞

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11 ① T细胞 + PHA  培养，淋巴母细胞转化  染色  计数转化细胞百分率
二. 淋巴细胞的功能测定技术 （一）体外法 1．淋巴细胞增殖试验 （1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验） ① T细胞 + PHA  培养，淋巴母细胞转化  染色  计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA  培养，淋巴母细胞转化 + 3H-TdR  测定cpm值 ③ T细胞 + PHA  培养，淋巴母细胞 + MTT  测定OD值

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13 （2）B细胞增殖试验 B细胞 + LPS  淋巴母细胞 + 3H-TdR  测定cpm值

14 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞  培养  靶细胞破坏，释放放射性核素  测cpm 值
2.细胞毒试验 (1) NK细胞的细胞毒活性测定 ① 放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞  培养  靶细胞破坏，释放放射性核素  测cpm 值 NK细胞毒活性(%)= 100% 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值

15 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞) LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸
盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值 NK细胞毒活性(%)= 100% 实验孔OD值-自然释放孔OD值 最大释放孔OD值-自然释放孔OD值

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17 (2) 细胞毒性T细胞(CTL)杀伤功能测定 靶细胞(51Cr-EB病毒转化的B细胞) + 淋巴细
胞 + 抗CD3 mAb  培养 取上清液(含 51Cr)γ计数器测cpm值 细胞毒效应(%)= 100% 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值

18 3. 酶联免疫斑点法 抗原包被  B细胞  抗体产生并附着  第 二抗体(酶标记) 底物  显色 抗体(抗细胞因子)包被  + T细胞  产生细 胞因子并与抗体结合  + 第二抗体(酶标记) 底 物  显色

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20 （二）体内法 抗原定量注入皮内，48～72小时后观察结果。 结果判定： 阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径>0.5cm 弱阳性：硬结直径<0.5cm 阴性：无变化 实际意义： 阳性 —— 细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性 —— 多为细胞免疫功能低下者 * 常用的抗原为结核菌素(OT) 、PHA

21 皮内注射法

22 划痕法