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实验目的： 1、了解PCR反应原理； 2、掌握PCR扩增的基本操作步骤
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聚合酶链式反应（PCR）五要素 引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA
引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA 缓冲液（内含Mg2+)
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引物浓度不宜偏高，否则： 容易形成引物二聚体 容易产生非特异性产物。 一般终浓度用0.1~0.5 pmol/μl(μM )较好。 贮存液：100 μM 工作液：10 μM
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本实验用Taq DNA聚合酶 1、延伸速度： 2~4kb/min 2、延伸长度： <6kb 3、最佳反应温度： 70~75℃
3、最佳反应温度： 70~75℃ 4、最佳Mg2+ 浓度：1~2mM Mg2+过高，非特异性增强； 过低， Taq DNA聚合酶活性减少 5、3’加A，便于 TA克隆 酶的浓度也要适中，过低过高都不好
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dNTP：dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的混合物
1.等摩尔浓度配制，否则就会引起错配 2.每种dNTP 50～200μmol/L 3.浓度过高会抑制PCR反应：与Mg2+ 螯合
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PCR缓冲液（10×）： 200mM Tris-HCl（ PH8.8） 100mM KCl 15mM MgCl2 100mM 硫酸铵 1% Triton X-100
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PCR反应程序 95℃预变性5 min， 94℃变性 30s-1min X℃退火 30 s-1min 30-35循环 72℃延伸Y min
4 ℃ 保存 X：Tm-(2~10) Y: 1kb扩增产物约1min
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反应体系 2.5 μl 10× PCR缓冲液 Buffer 0.5 μl 10 mM dNTP dNTP
0.5 μl μM 上游引物 P1 0.5 μl μM 下游引物 P2 1.0 μl ～100 ng/μl 模板DNA T 0.25μl U/ μl Taq DNA聚合酶 E 19.75μl dd H2O 25μl 反应体系
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