土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室.

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1 土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室

2 土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 化学生物学实验 6学时 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 仪器与试剂 4. 实验步骤 5. 思考题

3 化学生物学实验 2.实验目的 6学时 酶（土豆磷酸化酶）的分离 （1） 酶合成（直链淀粉） （2） 酶活性测定 （3）

4 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 土豆磷酸化酶的分离原理 （硫酸铵分级沉淀法，盐析法的一种）

5 1.实验原理 化学生物学实验 6学时 直链淀粉的合成原理

6 1.实验原理 + 2.3 检验磷酸根的原理 （酶活性测定原理）
化学生物学实验 6学时 检验磷酸根的原理 （酶活性测定原理） 无机磷酸根与钼盐的硫酸溶液可生成磷钼酸。磷钼酸可氧化metol（4-甲氨基酚硫酸盐），而这一氧化反应会发生从黄到蓝的颜色变化。此时可测定溶液的吸光度变化。氧化反应后溶液中的磷酸根量可通过与校正曲线的对比进行测定。 + 颜色由黄变蓝

7 3.仪器与试剂（1） 仪器与试剂 化学生物学实验 土豆磷酸化酶分离所需 直链淀粉合成和比色法测定所需
6学时 仪器与试剂 土豆磷酸化酶分离所需 直链淀粉合成和比色法测定所需 1.1g葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐二水合物，7mg麦芽七糖、3g枸橼酸氢二钠倍半水合物、3g枸橼酸三钠二水合物、一个pH计、适于冷冻和加热到100℃和离心1mL水溶液的离心管，一支移液器（1mL）、一个存储液氮的杜瓦瓶、一个加热快（100℃）、一台离心机、1mol/L三乙醇胺缓冲液、100mL水、20mL的2.5mol/L硫酸、20mL5%钼酸铵水溶液、0.2g硫酸对甲氨基酚、0.54g亚硫酸氢钠和一台UV光谱仪并带有适当的比色杯 2.5Kg土豆、削皮和切土豆用的一把刀、一个粉碎机、一台离心机和离心管（1L）、10g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、一台可控温搅拌器、一个搅拌子和一个三角瓶（2L）、1Kg硫酸铵、水和一台天平

8 3.仪器与试剂（2） 0.54g亚硫酸氢钠 20mL的5mol/L硫酸 20mL的5%钼酸铵水溶液
化学生物学实验 6学时 0.54g亚硫酸氢钠 20mL的5mol/L硫酸 磷酸盐试剂 （用于磷酸根浓度的比色测定） 混合物至少搅拌30min 20mL的5%钼酸铵水溶液 含有0.2g对氨基酚硫酸盐的100mL水溶液

9 4.实验步骤 用于酶法合成的沉淀 沉淀 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 上清液 化学生物学实验 土豆 1.离心 1.粉碎
6学时 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 土豆 1.离心 2.调pH至7.0 3.55℃搅拌40min 4.加硫酸铵（100g/L) 5.离心 1.粉碎 2.打成匀浆 土豆泥 上清液 用于酶法合成的沉淀 沉淀 1.加硫酸铵 2.离心 1.溶于水 2.加硫酸铵（350g/L)

10 4.实验步骤 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 化学生物学实验 STEP 1 STEP 2 STEP 3 STEP 4
6学时 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 STEP 1 STEP 2 STEP 3 STEP 4 将2.5Kg土豆去皮，切成小块在粉碎机中打成匀浆。匀浆在5000r/min离心30min，将上清液用Tris缓冲液调至7.0，并在55摄氏度加热40min 搅拌30min，离心，并收集沉淀置于500mL蒸馏水中，并向其中加入175g硫酸铵。搅拌30min，离心（10000r/min，30min）分出酶 将上述混合物冷却至室温，按每升液体加入100g固体硫酸铵 搅拌30min并在5000r/min离心后，再按每升液体250g硫酸铵加入上清液中。

11 从葡萄糖-1-磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示
4.实验步骤 化学生物学实验 6学时 4.2 直链淀粉的合成及比色测定 P.PH 直链淀粉 + Pi 葡萄糖-1-磷酸酯 + 引物 比色法测定 进行反应 生成产物 产物检测 从葡萄糖-1-磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示

12 4.实验步骤 使用同一比色杯测定！ 1.将0.1mol/L枸橼酸氢二钠与0.1mol/L枸橼酸三钠溶液混合，得一pH6.0缓冲液。
化学生物学实验 6学时 1.将0.1mol/L枸橼酸氢二钠与0.1mol/L枸橼酸三钠溶液混合，得一pH6.0缓冲液。 2.将1.1g（2.9mmol）葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐水合物和7mg麦芽七糖溶于50mL上述枸橼酸钠缓冲液，并加热至45℃。 3.将300mg酶溶于上述2mL枸橼酸钠缓冲液中，加入其中后，每30min从反应混合物中取1mL并立即冷冻保存于液氮中。刚加入酶后即采第一个样品。整个测定过程需要5-6个样品。 使用同一比色杯测定！ 4.样品100℃加热10min后离心，取100μL上清液加入2.9mL的1mol/L三乙醇胺缓冲液中，向其中加入7mL的磷酸盐试剂。15min后于578nm测定吸光度。

13 5.思考题 1 2 3 简述硫酸铵 分级沉淀法 纯化土豆磷 酸化酶的原 理 检验磷酸根 的原理 直链淀粉的 酶合成原理

14 Thank You ! 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室