第5章 蛋白質 目 錄 結束放映.

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1 第5章 蛋白質 目 錄 結束放映

2 胺基酸以胜肽鍵連接而成一條長線性的胜肽鏈(peptide chain)。蛋白質是由一條或多條胜肽
鏈所組合而成 。 5.1 幾種典型蛋白質 一、醣蛋白 (一) 結　構 醣蛋白(glycoproteins)是糖與蛋白質的複合物。

3 黏蛋白即蛋白聚糖(proteoglycan)，醣基部分為醣胺聚醣(glycosaminoglycan)，是一種長而不分支的多醣鏈，含有許多酸性基團，大多具有黏性，故稱為黏多醣(muco-polysaccharide)。 黏蛋白廣泛地存在於哺乳動物各種組織中，其中尤以結締組織含量最為豐富，是細胞間隙的主要成分。

4 (二) 種　類 醣蛋白中糖的種類只有十來種，主要是六碳糖（hexose，又稱為己糖），其次是五碳糖（pentose，又稱為戊糖），包括D-半乳糖(galactose)、D-甘露糖(mannose)、D-葡萄糖(glucose)、D-木糖(xylose)、L-阿拉伯糖(arabinose)、L-岩藻糖(fucose)、N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)和唾液酸（sialic acid，又稱為N-乙醯神經胺酸）等。糖苷鍵連接方式大多為O­酯鍵，少數為N­胜肽鍵 （如圖5-1）。

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7 (三) 功　能 醣蛋白中扮演不同的生物功能。例如：病毒外膜所含有的表面醣蛋白與其對寄主的吸附作用有關；酵母菌和植物細胞壁的醣蛋白則是一種結構成分；在高等動物中上皮細胞(epithelial cell)所分泌的醣蛋白具有保護和潤滑作用；血液中的許多醣蛋白擔負著運輸、血液凝固和免疫等功能。

8 二、脂蛋白 (一) 結　構 脂蛋白(lipoproteins)是由脂質和蛋白質結合而成。共價性結合，則至少有三種方式： 1.酯鍵 2.醯胺鍵 3.硫醚鍵 脂蛋白中的蛋白質部分稱為脫輔基蛋白(apoprotein)，脫輔基蛋白富含厭水性胺基酸區域，易於與脂質結合。

9 (二) 生物體中的脂蛋白 脂蛋白廣泛存在於細胞和血液中；細胞脂蛋白的脂質主要是磷脂，其次是醣脂。 細胞脂蛋白主要存在於細胞膜（少量存在於細胞核內），它們往往又含有糖，因而也是醣蛋白。 血漿脂蛋白是存在於動物血液中的一類可溶性脂蛋白，可溶解於血漿中。脂蛋白的主要功能是運輸脂肪族及固醇類脂質。

10 根據密度大小，血漿脂蛋白可分為幾種不同 類型： 1.乳糜微粒(chylomicron, CM)：含脂質99%以 上、蛋白質0.2~0.5%。 2.極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)：含蛋白質5~10%、脂質 約90%。 3.低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)：含蛋白質25%、脂質75%。

11 4. 高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)：所含蛋白質和脂質大約各佔一半。
功能是將肝外組織的膽固醇及磷脂運輸入肝內。 5. 極高密度脂蛋白(very high density lipoprotein, VHDL)：蛋白質佔99%，脂質佔1%。功能是運輸游離脂肪酸。

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13 三、膠原蛋白 所有多細胞生物都含有膠原蛋白(collagen)，是哺乳動物最為豐富的一種蛋白質，約佔其總量的25%， (一) 膠原蛋白的胺基酸組成和排列 膠原蛋白的胺基酸排列是以每三個胺基酸為一個重複單位，X-Pro-Gly 或X-Hyp-Gly，X可以是任一種胺基酸，但通常是Pro或Hyp，第三個胺基酸總是甘胺酸，因為膠原是一種三股螺旋結構，每個重複單位的第三個殘基剛好位於螺旋內，只有甘胺酸能小到位於螺旋內。其他兩個殘基的R基處於螺旋的外部（圖5-2）。

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15 (二) 膠原蛋白的基本結構單位 膠原蛋白基本結構單位稱為原膠原(tropocollagen)。原膠原分子定向排列整齊，分子之間通過共價交聯，形成穩定的膠原微纖維，再由許多微纖維聚集成膠原蛋白。

16 四、免疫球蛋白 當生物受到外來抗原(antigen)的刺激而產生抗體(antibody)，抗體與抗原會進行免疫反應，故又稱抗體為免疫球蛋白(immunoglobulin)。

17 (一) 免疫球蛋白的生成 免疫球蛋白是由漿細胞(plasma cell)產生的，而漿細胞由淋巴細胞(lymphocyte)轉變而來。淋巴細胞有兩大類：T淋巴細胞和B淋巴細胞，這兩類淋巴細胞均起源於骨髓。在發育時受到胸腺(thymus)的控制，轉變成胸腺依賴性淋巴細胞，簡稱T細胞；

18 另一部分細胞在鳥類受到法氏囊(Bursa Fabricii)所控制，轉變成囊依賴性淋巴細胞(dependence of lymphocyte on bursa)，
T細胞主要負責細胞性免疫(cellular immunity)作用，B細胞則是體液性免疫(humoral immunity)作用。

19 (二) 種類與結構 每一個免疫球蛋白分子由四條胜肽鏈所構成，兩條相同的長鏈稱重鏈或H鏈(heavy chain)，兩條相同的短鏈稱輕鏈或L鏈(light chain)。各鏈間透過雙硫鍵連接成一個Y字形（圖5-3）。無論重鏈或輕鏈，都各有兩個特化的區域：可變區（variable region，簡稱V區）和恆定區（constant region，簡稱C區）。

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21 根據重鏈恆定區結構的不同，以及物理化學性質和免疫學特性的不同，將Ig分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE（依據正常人血漿濃度遞減順序）。根據輕鏈恆定區抗原特異性的不同，則可分為κ(kappa)和λ(lambda)兩型。

22 5.2 蛋白質結構與功能 一、鐮刀形紅血球貧血症 鐮刀形紅血球貧血症(sickle cell anemia)即因病人在缺氧時紅血球變為鐮刀狀而得名。 和正常人的血紅蛋白(HbA)相比，鐮刀形貧血症病人血紅蛋白(Hbs)在鏈第六位的麩胺酸被纈胺酸所取代，由於這個胺基酸在穩定血紅蛋白的空間結構佔有很重要的地位，因此這種"病變的"血紅蛋白在紅血球表面聚集時，降低了細胞膜的穩定性，使得紅血球變成彎月狀（鐮刀形），攜帶氧的能力也大大降低，導致貧血的現象。

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25 二、蛋白質酵素的活化 有一些蛋白質在細胞內剛合成時並無活性，它必須按特定程式產生斷裂才會具有活性，這個過程叫做活化(activation)。

26 (一) 凝血與溶血作用 在血液中存在與血液凝固有關的兩個系統；凝血系統和溶血系統。這兩套系統是由多種蛋白質的活化系統來實現的。 血液凝固過程有兩個主要環節；一是血漿中的凝血酶原(prothrombin)受到血小板(platelet)中一些因子的活化而形成凝血酶(thrombin)；二是血漿中的纖維蛋白原(fibrinogen)在凝血活化下轉變成不溶性纖維蛋白(fibrin)網狀結構，使血液變為凝膠狀，使血液在創傷處不致外流，產生保護作用。

27 血液中還存在另一套系統，即纖維蛋白溶解酶原(profibrinolysin)，它被活化後轉變成纖維蛋白溶解酶(fibrinolysin)，可將纖維蛋白溶解。

28 (二) 胰島素原的活化(Proinsulin Activation)
胰島素(insulin)含有A、B兩條鏈，但它的前驅物(precursor)—胰島素原(proinsulin)卻是單一條胜肽鏈。胰島素原在體內被類胰蛋白酶(tryptic analogue)活化，切去C胜肽後轉變成有活性的胰島素（圖5-4）。 (三) 異位調節作用 一些蛋白質利用其主體結構的改變來調節其生物活性，使蛋白質能配合生理環境的需求發揮其功效，完成複雜的生物機能，稱之為異位作用

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30 三、蛋白質的變性 蛋白質在某些外在因子影響下，可引起其物理化學性質的改變，乃至喪失生物功能，稱之為蛋白質變性。 蛋白質的變性來自於外在因子破壞了維繫蛋白質高級結構的化學鍵，，從而影響蛋白質的生理功能，不同的變性因素對蛋白質高級結構的影響機制不盡相同。

31 1. 溫度：加熱使蛋白質變性稱為熱變性(thermal denaturation)。多數熱變性是不可逆性。
2. 尿素和胍(urea and guanido)： 尿素和鹽酸胍是常用的蛋白質變性劑。二者的結構如下：

32 6M以上的鹽酸胍可使多數蛋白質分子由緊縮的立體結構變得鬆散、四級結構解離成次單元，發生凝集和沉澱。
3.表面活性劑(surface-active agent)：表面活性 劑通常是同時具有厭水性與親水性基團的兩性 分子(amphipathic)，例如常用作蛋白質變性 劑的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)

33 SDS為一種陰離子表面活性劑，即使在很低的濃度下，也能與蛋白質高度結合，每克蛋白質可結合1
SDS為一種陰離子表面活性劑，即使在很低的濃度下，也能與蛋白質高度結合，每克蛋白質可結合1.4克SDS。SDS的非極性部分與蛋白質分子內部的厭水基團相互作用，而硫酸根與蛋白質分子表面的親水基團或水分子作用，致使蛋白質分子立體結構發生很大變化：寡聚體解離成次單元；分子（或次單元）由球狀變為細桿狀，螺旋度大大增加。

34 4.有機溶劑(organic solvent)：有機溶劑可以影 響靜電力、氫鍵和厭水作用，從而導致蛋白質 的立體結構變化。

35 5.3 蛋白質性質的測定 一、分子量的推測 (一) 分析化學法 定量測定蛋白質中某一特殊元素的含量，可以測得蛋白質的最低分子量。化學方法測得的蛋白質的最低分子量只有和別的物理化學方法配合使用時，才能得出真實的分子量。 但是，根據最低分子量算出的真實分子量是比較精確的。

36 (二) 超高速離心法(Ultracentrifugation)
利用離心力作用可將懸浮溶液中的各種成分加以分離。如果在液體中懸浮的質點，其比重大於液體的比重時，就會因重力作用而移向容器底端，稱之為沉降作用(sedimentation)。沉降的速度與質點的大小成正比。

37 浮在液體中的質點因擴散作用(diffusion)，由高濃度向低濃度運動，這是抗拒沉降的力量。擴散作用與沉降作用的方向相反，較小質點的擴散速度較大，沉降速度則較小；較大的質點（如蛋白質顆粒）則相反。對於一個純化的蛋白質，在強大的離心力下，根據它的沉降時間即可測定它的分子量。

38 在離心場中，蛋白質分子所受到的淨離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦阻力平衡時，單位離心力場下的沉降速度為一定值，稱為沉降常數或沉降係數(sedimentation coefficient)：

39 式中：x為離心介面與轉子中心之間的距離（釐米）；t是離心時間（秒）；dx/dt為離心速度；為轉頭的角速度（孤度‧秒CC1）；2x即相當於離心力場下的加速度。
因為速度÷加速度＝時間（或速度＝加速度×時間），所以沉降係數的單位為秒。 用超高速離心法測得的一些蛋白質的分子量見（表5-1）。

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41 二、沉澱作用 天然蛋白質溶液是穩定的親水膠體狀態，這種穩定性乃由兩個因素所決定：其一為水化作用(hydration)。 其二為電荷排斥作用(charge repel)。

42 蛋白質的穩定性對於生物有機體來說是必要的，當其改變條件時，這種穩定性就會被破壞，使蛋白質從溶液中沉澱出來。
沉澱蛋白質的方法有很多種，主要就是破壞水化膜和電荷效應這兩個穩定因子。 1.中性鹽溶液：中性鹽對蛋白質的溶解度有雙 重影響：低濃度的中性鹽可以提高蛋白質的 溶解度，這種現象稱為鹽溶作用(salting- in)，高濃度的中性鹽則降低蛋白質的溶解 度，可使蛋白質沉澱，稱為鹽析作用 (salting-out)。

43 由於不同蛋白質表面的水化程度及帶電荷量不同，在製備蛋白質時，通常用不同濃度的中性鹽來分別沉澱各種不同蛋白質，這種方法謂之分段鹽析(fractional salting-out)。用鹽析法製備蛋白質，一般不會破壞蛋白質的生物活性。 2.有機溶劑：由於有機溶劑往往能使蛋白質變性 失去活性，因此宜用稀濃度的有機溶劑，並要 攪拌均勻，在低溫下操作。 3.重金屬鹽類：當pH值大於蛋白質的等電點時， 蛋白質分子帶負電荷，此時加入Ag＋、Hg2＋、 Pb2＋等重金屬時，即可與蛋白質結合成不溶性 的鹽。

44 4.酸性試劑：使溶液pH值小於蛋白質的等電點， 蛋白質分子淨電荷為正，進而與試劑結合生成 不溶性沉澱。
用重金屬和酸性試劑沉澱的蛋白質往往失去活 性，而不能用於製備活性蛋白。

45 三、胺基酸的組成與序列分析 (一) 預處理 在進行胺基酸序列分析前，必須先行除去胜肽鏈間或鏈內的氫鍵、雙硫鍵等作用力以解構分子的主體結構。 1.氧化雙硫鍵：

46 2. 防止再氧化

47 3.還原雙硫鍵

48 (二) 胜肽鏈組成分析 1.胺基酸組成分析(amino acid composition analysis)： 將蛋白質樣品用6M HCI在110℃下封管水解24 小時，然後用胺基酸分析儀(amino acid analyzer)測出胺基酸的種類，以及每種胺基 酸的相對百分比含量。再計算每種胺基酸的殘 基數。

49 2.胜肽鏈末端分析(peptide chain end-group analysis)：
(1)N-端測定(N-End Determination)： A.DNFB法 （Sanger法，dinitrofluorobenzene method）：

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51 所生成的DNP-胺基酸為黃色化合物。 與標準DNP-胺基酸比較即可鑑定胜肽鏈的N-端是什麼胺基酸。

52 B.苯異硫氰酸鹽法（Edman法，phen-
ylisothiocyanate method）

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54 所生成的PTH-胺基酸用乙酸乙酯抽提後，再進行鑑定。現有測定胺基酸序列的胺基酸順序儀(amino acid sequencer)基本上都是根據此原理設計的。
C.丹磺醯氯法（DNS法，dansyl chloride method）： DNS與胜肽鏈N-端作用，生成DNS-胜肽鏈，再 用酸水解可得到DNS-胺基酸，可用螢光檢測法 進行鑑定，因為DNS-胺基酸有螢光。 此法靈敏度高。

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56 D.胺胜肽酶法(aminopeptidase method)
(2)C-端測定(C-end-group determination)： A.胼解法(hydrazinolysis method)

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58 B.羧胜肽酶法(carboxypeptidase method)：
羧胜肽酶(carboxypeptidase)將多胜肽或蛋白質在pH8.0、30℃時與羧胜肽酶作用，依據一定的時間間隔取樣分析，測定所釋放出來的胺基酸的種類和數量，即可知道C-端的胺基酸排列順序。

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61 (三) 裂解成較小片段 為便於順序分析，需將一條長的多胜肽鏈裂解成約含10~15個殘基的小片段(small fragment)，這些小片段很容易用Edman 法進行序列分析。 1.化學方法：最常用的是用溴化氰(CNBr)處理。 2.酶裂解法：常用胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋 白酶(chymotrypsin)。

62 將小片段分離（方法見第7章），然後即可用Edman降解或利用胺基酸順序儀測定每個小片段的胺基酸順序，最後將所有已知順序的小片段進行重疊比較，確定整個胜肽鏈的胺基酸順序。
應用這種所謂片段重疊法(fragment overlapping method)，Frederick Sanger等人(1955)首先確定了牛胰島素(insulin)的結構。胰島素是由兩條胜肽鏈組合而成的，其結構見（圖5-6）。

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