第三节 细胞及其组分的分离纯化和分析.

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1 第三节 细胞及其组分的分离纯化和分析

2 流式细胞分选仪

3 4. 计算机系统：将收集的光信号转换成 数字信号再进行处理分析 数据显示： ①直方图：横标以道数表 示，代表所测荧光或散 射光强度纵标表示细胞 的相对数 优点：可定性，可定量 缺点：只能显示一个参 数于细胞之间的关系

4 ②二维图：横、纵标分别表示与细胞有关的两个独立参数，平面上的每个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。
优点：显示两个独立参数与细胞相对数 之间的关系，反应信息量大 缺点：细胞 点密集的地 方难以显示 它的精细结 构

5 ③ 二维等高图：等高图上每连续曲线代表具有相同细胞数的细胞群，即等高。曲线层次越高，代表的细胞数越多。

6 （二）、样品的制备 1.制备单个细胞悬液 分离不同类型的细胞后用蛋白水解酶（胰蛋白酶、胶原酶）消化细胞间结合物质或用金属离子螯合剂（乙二胺四乙酸 EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，然后用轻微的机械方法即可制备成单个细胞悬液。

7 2. 细胞固定、染色 活细胞无需固定，死细胞用甲醛、乙醇、丙酮固定。流式细胞标本一般可不染色，但要观察细胞内特殊分子（如DNA，RNA）则需染色。 3. 细胞分选

8 流式细胞分选仪

9 二、细胞组分的分级分离

10 原理： 利用颗粒大小的不同: 差速离心法 速度区带离心法 利用颗粒密度的不同: 等密度离心法

11 1、差速离心法：用于分离大小、形状不同显著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离

12 2、速度区带离心法：用于分离大小差别不 显著的组分

13 3、等密度离心法： 按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了DNA的不保留复制。

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15 三、层 析

16 1、纸层析

17 2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。

18 常用方法： 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析

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22 四、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
电泳（electrophoresis）: 在含有蛋白质分子的溶液里加上电场，蛋白质就会按照它的净电荷、大小和形状，以一定的速度在电场中移动，这一技术叫电泳。

23 聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－亚甲双丙烯酰胺聚合而成

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26 目的：单向SDS－PAGE电泳分辨力差，只能分开50左右种的蛋白。双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为2000～15000种。
五、双向电泳 目的：单向SDS－PAGE电泳分辨力差，只能分开50左右种的蛋白。双向电泳可分辨1000种以上的蛋白质，一般为2000～15000种。

27 步骤： 1、等电聚焦电泳：

28 2、在垂直于第一次电泳的方向上进行 SDS－PAGE电泳