Protein Purification (I)

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1 Protein Purification (I)
蛋白質體學 Proteomics 2016 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 Protein Purification (I) 陳威戎

2 ■ 蛋 白 質 純 化 階 段 及 分 析 方 法 A B (1) 粗蛋白 (2) 部分純化 (3) 均質酵素 Crude protein
Purification B Analysis Material Background knowledge about Material Protein / Activity assay Extraction (1) 粗蛋白 Crude protein (1) Crude Protein (1% pure) Electrophoresis Naive-PAGE SDS-PAGE Gradient PAGE Protein fractionation Ammonium sulfate Organic solvent Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient determination Quaternary structure Isoelectric focusing Peptide mapping Chromatography (2) 部分純化 Partially purified Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography FPLC (2) Partially Purified (50~90% pure) 圖 2.1  酵素純化階段與各種分析方法： 純化三階段所用到的一些純化與分析方法，將一一在本課程講述，但我們只能焦聚在前面兩個階段，尤其是色層分析法以及電泳法；第三個階段的各種分析方法，都是可以獨立成一門課的高階技術工具，請去修習相關的課程。 Electrophoresis Preparative electrophoresis Isoelectric focusing Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient Pure Enzyme (3) 均質酵素 Homogeneous Antibody production Immunoassays Immunoblotting ELISA Double diffusion Immunoelectrophoresis (3) Homogeneous (>99%) Monoclonal or conventional X-Ray crystallography Crystal Spectrometric methods CD, ORD, NMR & ESR Juang RH (2007) EPA

3 蛋白質純化方法 鹽溶鹽析 膠體過濾法 離子交換法 親和層析法 純化策略 最經濟方便的純化 依照分子大小分離 利用分子電荷性質
最具專一性的吸著 善用分子各種特性 說明文字

4 ■ 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area A typical protein Activie site
一個蛋白質分子表面的可能情況： 雖然說上面是一個水溶性的蛋白質 (SOD)，其表面也多少會有一些非極性的部份，而非極性部份的面積大小，則隨每一種蛋白質而有差異。水溶性蛋白質的內部大多由非極性的胺基酸所佔據，若有一些極性胺基酸的集結地點，並且形成凹陷的口袋狀，就極有可能是其活性區了。 Activie site Superxoide dismutase (SOD) A typical protein Protein surface has both polar and non-polar patches. Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig

5 + - ■ 環 10 境 影 響 9 分 子 的 8 帶 電 性 7 質 6 5 4 3 Buffer pH
Isoelectric point, pI 胺基酸基團的正負電荷總和成就了蛋白質的帶電性質： 蛋白質上面的胺基酸有許多帶電基團，這些帶電基團會隨著環境 pH 的改變，而有所變動 (為什麼？)。在某一個 pH 下，蛋白質上的正電荷數目與負電荷相等，也就是淨電荷為零，則此 pH 特稱為此蛋白質的等電點 pI。 因此，在環境的 pH = pI 時，蛋白質雖然還是帶有正、負電荷，但其淨電荷為零；若環境 pH > pI 則其淨電荷為負，反之則為正。也就是說，一個蛋白質的電荷正負與多寡，決定於環境 pH 的大小。因此緩衝液對一個蛋白質的性質，就非常重要，因為緩衝液可維持穩定的 pH，會使得蛋白質有穩定的電荷性質，不會隨著環境 pH 的飄動而一直變動著。 衍生的一個問題是，蛋白質為何要維持穩定的電荷性質？ 與其活性有關係嗎？ + - Net Charge of a Protein Environmental pH effects the charge properties of a protein Juang RH (2007) EPA

6 NaCl concentration (M)
■ 提高鹽濃度增加蛋白質溶解度 Solubility pI [NaCl] 0.005 M 0.02 M pH > 5.2 0.01 M 蛋白質的溶解度，受到溶液中的酸鹼度及離子濃度影響很大： 當溶液中的酸鹼度逐漸接近某蛋白質的等電點 (例如 5.2) 時，此蛋白質的溶解度會漸漸下降，這是因為蛋白質分子上的淨電荷漸漸趨向零，蛋白質分子之間的 互斥力降低 所致； 此外，這個淨電荷為零的蛋白質分子上，事實上還是有數目相同的正負電荷，這些正負電荷對互相吸引也有貢獻。可以利用這種特性，來沈澱出某已知等電點的蛋白質。 但若溶液中的 鹽濃度 漸漸提高，則蛋白質的溶解度也會提高，這是因為鹽所解析出來的大量正負離子，會阻斷上述正負電荷間的相吸，因而使得蛋白質溶入水中。當然，越遠離此蛋白質的等電點，這種溶入現象越是顯著。上面兩圖所說明的，都是這種鹽溶的性質，只是座標表現方式不同，所強調的表達意義稍有不同。 0.001 M pH = 5.2 pH NaCl concentration (M) Salting in Higher salt concentration increases the solubility of a protein Juang RH (2007) EPA

7 ● 鹽溶 Salting-in: ● 鹽析 Salting-out:
■ 鹽影響蛋白質溶解度 Salt effects protein solubility ● 鹽溶 Salting-in: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中 ● 鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來 摘要： 說明 Juang RH (2007) EPA

8 ■ 鹽溶 Salting-in effect Solubility - - Ionic strength
+ Solubility - + - + NaCl + = - NaCl KCl - + + - 圖 2.3  鹽溶方法的原理圖解： - + + = - Ionic strength 分子在其等電點時，容易互相吸引，聚合成沈澱；加入 鹽離子會破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。 Juang RH (2007) EPA

9 A little salting-in effect
■ 鹽析 Salting-out Ionic strength Solubility + - NH4 + A little salting-in effect Ammonium sulfate SO4 2- 圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解： Sodium sulfate Aggregate 蛋白質分子表面的疏水性區域，都聚集許多水分子，當鹽類加入 時，這些水分子被抽出，以便與鹽離子進行水合，暴露出來的疏 水性區域互相結合，形成沈澱。 = hydrophobic Juang RH (2007) EPA

10 ■ 硫酸銨 (ammonium sulfate) 的特性
(1) 硫酸銨是一種中性鹽，對蛋白質有相當好的 安定作用。因其離子容積大，吸走水分子的能力也大，為有效的鹽析工具。 (2) 硫酸銨的添加以百分飽和度來表示 (不是濃度百分比)，大部分蛋白質可在 80% 硫酸銨飽和度下沉澱。 (3) 飽和度隨溫度變化稍有差異，25℃下的飽和濃度為4.1 M，即每公升加入 767 克固体硫酸銨；0-100% 之間各飽和度的添加量要查表，而不是以 767 克直接乘以其百分比值 (%)。 (4) 各種蛋白質，因其表面的非極性區域分佈不同，各在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉澱，一般可做為初步的純化。 圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解：

11 ■ 硫酸銨百分飽和濃度表 0℃ 最終硫酸銨百分飽和濃度 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數 硫酸銨起始百分飽和濃度 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 603 697 27 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 469 557 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 522 28 86 117 148 181 214 249 285 323 402 488 57 87 118 151 184 218 254 369 453 29 58 89 120 153 187 222 335 418 59 123 156 190 302 383 92 125 159 268 348 61 93 127 161 235 313 31 62 95 129 201 279 63 97 168 244 32 209 101 174 34 139 本表數據來自Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291，而該表原始資料又來自Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press. 圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解：

12 ■ 硫酸銨 (ammonium sulfate) 的使用法
(1) 硫酸銨容易吸收空氣中的水分而結塊，使用前最好先把硫酸銨磨碎，平鋪在烤箱 (約 60℃) 內烘過，切勿過熱。 (2) 添加硫酸銨時，要在冰浴中進行，不可一次把硫酸銨倒入，而以小量分多次慢慢溶入，並不時攪拌，以免造成局部濃度過高。 硫酸銨全加完後，再攪拌約 min，使溶解完全平衡，然後進行離心，注意所要的是沉澱或上清，要弄清楚！ (3) 最後所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中，或者以沉澱形式保存，均 相當安定；但要記得其中所含的硫酸銨，是否對下一步檢定或純化有影響，可以透析法除去之。 圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解：

13 ■ 有機溶劑沈澱法 Precipitation by organic solvent
- + Solubility - + - + - + Membrane protein - + Water-soluble protein Water-soluble 有 機 溶 劑 Organic solvent 圖 2.5  有機溶劑沈澱法的原理圖解： - + protein Solvent % 降低水活性，使溶液的介電常數下降，增加蛋白質溶質分子之間 的作用力，因而聚集在一起。 = hydrophilic Juang RH (2007) EPA

14 ■ 各種鹽析沉澱法比較 Comparison of methods
Juang RH (2007) EPA ■ 各種鹽析沉澱法比較 Comparison of methods Salting-in 鹽溶 Salting-out 鹽析 Organic solvent Ionic interactions on protein surface Non-polar area of protein surface All interaction forces on protein surface except hydrophobic Factors Reagents Mechanism Fig Remarks NaCl (monovalent) (NH4)2SO4 (divalent) Methanol, acetone Protein has no net charge at its pI, that leads to the binding between proteins via ionic interactions, and precipitation. Salt can interfere these ionic interactions and separate bound protein molecules. Big divalent ions attract water molecules immobilized on the protein surface, expose the non-polar surface, which then interacts with other proteins to form precipitate. Organic solvent decreases the water activity and the dielectric constant of the solution, which then decreases the solubility of the protein and precipitates it. 表 2.1  各種鹽析及沉澱法的比較： Fig 2.3 Fig 2.4 Fig 2.5 1) Some proteins might be denatured by heat produced. 2) Factors facilitate precipitation: larger protein, pH close to protein pI. 3) Lipophilic protein might be dissolved more readily. The reverse process of salting-in is not salting-out, it is the dialysis process against a dilute solution. 1) Non-polar proteins will be precipitated earlier. 2) Protein is very stable in ammonium sulfate.

15 ■ 其他處理法 Polyethylene glycol (PEG)：是一種水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉澱蛋白質，其作用原理類似有機溶液，但使用濃度較低。 去除核酸及多醣：樣本溶液中若有大量核酸，可以加 protamine sulfate (魚精蛋白) 與之產生沉澱，再以離心去除之。碳水化合物則較難完全去掉，通常期望在蛋白質沉澱時，或往後的層析法能去除。二者都可以用對應的水解酵素分解，但價錢昂貴。 特殊處理：有些較特別的酵素，具有特殊性質，可利用在純化上。 例如 RNase 對熱非常安定，欲純化時可將粗酵素液加熱煮沸，除去其它蛋白質。對強酸、強鹼或有機溶劑的特殊安定性，亦可利用之。不過使用這些嚴苛的處理方法時，要特別小心控制好其正確條件。 圖 2.4  鹽析 salting out 方法的原理圖解：

16 3 色層分析法 Chromatography 3.1 色層分析原理 Basic principles
極性不同的分子在兩相中有不同分佈比例 3.2 膠體過濾法 Gel filtration 依樣本分子量的不同來做分離純化 3.3 離子交換法 Ion exchange 利用樣本分子的表面帶電性質不同來進行分離 3.4 親和性層析法 Affinity chromatography 利用分子間的親和性大小不同來進行分離 3.5 疏水性層析法 Hydrophobic interaction chromatography 利用樣本分子的表面疏水性性質不同來進行分離 說明文字 Juang RH (2007) EPA

17 ■ 色層分析法的演進過程： 容量更大 Paper partition chromatography (PPC) 圓形濾紙 管柱層析 薄層層析
Martin, Synge (1952) ■ 色層分析法的演進過程： Paper partition chromatography (PPC) 圓形濾紙 管柱層析 薄層層析 (TLC) 長條濾紙 加展開液 說明文字 容量更大 容量變大 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.9

18 ■ 色層分析法的基本機制： Like Dissolves 說明文字 極性相似的兩分子間，其親和力較強。 極性 → 極性 非極性 → 非極性

19 ■ 色層分析法的基本原理： A B C S 兩相系統 L L L 流動相 固定相 ADSORPTION PARTITION Mobile
樣本 樣本 非 極 性 極 性 S 每次分離樣本 都要做一次選擇 One Plate of Separation L L 非 極 性 說明文字 極 性 L (理論板數) 流動相 Mobile phase 固定相 Stationary phase ADSORPTION PARTITION 樣本分子依其分子極性 選擇親和兩相之一 Liquid - Solid Liquid - Liquid

20 Affinity chromatography Hydrophobic interaction Hydroxyapatite
■ 常用層析法 Common chromatographic methods Adsorption Partition Gel filtration Reverse phase chromatography Ion exchange Affinity chromatography Hydrophobic interaction Hydroxyapatite Small molecules Large 表 3.1  各種大小分子的色析法應用： PPC, TLC, GC TLC, GC Juang RH (2007) EPA

21 ■ 薄層層析法操作 Thin-layer chromatography
Thin-layer plate Activated 說明文字 Not-activated Add developer Developing Sample spotting Juang RH (2007) EPA

22 3.2.5 問題及解決 Problem and solution
3.2 膠体過濾法 Gel filtration 3.2.1 原理概述 Basic principles 是一種 partition 層析法 3.2.2 膠体介質 Gel materials 是一種長鏈的大分子聚合物 3.2.3 膠体管柱 Gel and column 管柱性質、影響因素及管柱系統 3.2.4 管柱操作 Column operation 裝填並操作一支膠体過濾管柱 3.2.5 問題及解決 Problem and solution 常見的錯誤要先避免之 說明文字 Juang RH (2007) EPA

23 樣本 ■ 膠體過濾法是一種 Partition 層析法： Stokes radius 大分子 小分子 分子大小、 形狀 流 動 相 固 定
說明文字 大分子 小分子 被延滯 較快流出

24 Pharmacia Bio-Rad ■ 各 種 色 析 膠 體 ： Sephadex Sepharose Sephacryl
Sephacel glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose FPLC Superose, Superdex Mono Q, Mono S 說明文字 Bio-Rad BioGel P BioGel A acrylamide agarose

25 Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.35
■ 膠 體 的 構 成 Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.35 Space for filtration 說明文字 glucose unit Sephadex Sephadex is the polymer of glucose with chemical cross-linking

26 ■ 膠體的使用範圍 Sephadex G ● MW ranged from ten to several hundred thousands
G-200 could be smashed flat easily (its backbone support is too weak) 說明文字 From powder to gel form 1 g → 20 mL gel 1 g → 7.5 mL Small proteins Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.37

27 Sephacryl ■ 膠 體 的 構 成 Acrylamide Cross-linking Bigger space
Stronger support for backbone 說明文字 Acrylamide Cross-linking Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.22 Sephacryl

28 ■ 洋菜膠體的成膠反應 Agar gel formation
說明文字 Even stronger backbone Much bigger space Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.38, 39

29 Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.40
■ 膠體的使用範圍 Sepharose ● MW ranged from ten thousands to several millions Cross-linking Sepharose is rigid 說明文字 6% gel 2% gel Sephadex Large proteins Sephacry Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.40

30 ■ 膠體過濾法的膠球： 說明文字

31 ■ 管柱內膠體的組成區隔 Spaces in a column
Vt Vo Vt - Vo 膠 體 外 積 膠 體 內 積 管 柱 總 體 積 說明文字 Mobile phase Stationary phase Adapted from Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.11

32 A ■ 膠体過濾的溶離圖譜 A typical chromatogram Elution Volume (mL) Y X E Z Vo Ve
Vt 之後不 應有物質 溶離出來 X Ve E Vo 圖 3.4  膠體過濾法的典型溶離圖譜： Vo 之前不應有 物質溶離出來 Enzyme activity Z NaCl Vt Elution Volume (mL) Juang RH (2007) EPA

33 ■ 介 質 的 粗 細 影 響 解 析 力 Relative amount Poor separation Peak flattened
50 100 Poor separation Peak flattened Coarse 50 100 Fine Relative amount 介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。 介質粒子的大小，好像電視銀幕的解析度，粒子越小，解析力越好。粒子小可以降低粒子之間的空間，這些空間太大是降低解析力的原因之一 (見下圖)。 但因為粒子塞滿了所有空間，使得溶離液流過的速度變慢；流速太慢反而會導致解析力變差。 50 100 Best separation Superfine Adapted from Pharmacia: Gil Filtration – Principles and Methods 0.5 1.0 1.5 Ve/Vt Bead size is critical to the resolution of gel chromatography

34 ■ 溶離液擴散進出膠球 Diffuse in and out bead
圖 3.3  溶離液是以擴散方式進出膠體： 溶離液或樣本分子，由膠體粒子外圍均勻向內或外擴散。 Sample or buffer is diffusing in and then out of the gel particle. Diffusion Dispersion Juang RH (2007) EPA

35 ■ 溶離液對膠球的擴散或瀰散 Two types of gel
圖 3.3  瀰散式膠體有較好的通透性： 若膠體粒子太大，則由外圍擴散 到內部的距離長，通過粒子所需 要的時間拉長，降低分離效果。 Dispersion (瀰散) 方式的膠體 因通透性佳，溶離液可直接流 入膠體，不再靠擴散作用。 Small particle size reduces the diffusion time and increases the resolution of the gel Dispersion type gels let the sample molecules flow directly through the gel body, and have better resolution Juang RH (2007) EPA

36 ■ 粒子粗細影響溶離液流動 Bead size vs flow rate
上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。 粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。 膠體的顆粒越小 其解析力越大 但流速變慢 Smaller particles also reduce the space between the beads, and prevent the turbulence as the buffer flows, but the flow rate might be decreased Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.192

37 ■ 不 同 介 質 的 運 用 選 擇 Elution volume Absorbance Sephacryl S-300 100
50 100 高分子量處 分離較好 色帶都較晚 溶離出來 Absorbance Sephacryl S-200 50 100 若解析力差不多，儘快讓你要的蛋白質早點出來： 通常你都可以選擇多種膠體，但經常都是優劣互見。但若無特別考量，請選擇可讓你的蛋白質早一點流出來的膠體介質。當你要分別純化上圖紅色或青色兩個色帶時，你的選擇如何？實際去試試看，可能是最簡便的方法。 低分子量處 分離較好 色帶都較快 溶離出來 Adapted from Pharmacia: Gil Filtration – Principles and Methods Elution volume Choose the gel which brings your target protein out of the column earlier

38 ■ 色 析 管 柱 的 形 狀 300 cm3 矮胖型 細長型 ● 矮胖型管柱不能容忍分離不佳 但其流速及容量均較大 30 cm2
Short and fat 細長型 Long and slim 說明文字 ● 矮胖型管柱不能容忍分離不佳 Fat column cannot tolerate poor separation 但其流速及容量均較大 But it has better flow rate and higher capacity Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.195

39 ■ 液 相 層 析 管 柱 系 統 梯度製造器 幫浦 記錄器 緩衝液 管柱 膠體 監視器 分劃收集器 Gradient mixer (2)
轉接器 Connector 幫浦 Pump (1) adapter 記錄器 Recorder 緩衝液 Buffer (3) (4) 圖 3.5  液相層析管柱系統： 管柱 Column 膠體 Gel 監視器 Monitor (5) 分劃收集器 Fraction collector reservoir 膠 體 裝 填 The whole family of liquid chromatography apparatus Juang RH (2007) EPA

40 ■ 膠柱裝填方法 Packing column step by step
清洗膠體 Wash gel well Put on reservoir Put on adaptor 上清 Supernatant 預估體積 Estimate gel volume 檢查管柱 是否暢通 裝填膠體 Pouring gel smoothly 沈積中 In progressing Check flow rate of empty column Gel 緊 密 堆 積 多練習膠柱的裝填，並注意所有預先設定的條件。 預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。 已堆積 Sediment 靜置膠體 Gel stands o/n 溫度平衡 Temperature equilibrated 緩衝液 平衡 Equilibrated in buffer 加壓流洗 Elute under High pressure Gel 暫停流洗 Stop elution 繼續流洗 Keep eluting 1 2 X Gel should be packed tightly Juang RH (2007) EPA

41 ■ 色析膠體的裝填 Packing column
說明文字 Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods 一口氣倒入膠體，勿陷入氣泡。 Pour gel slurry smoothly (non-stop), avoid trapping any bubble

42 ■ 膠體過濾法注意事項： (I) 膠體處理與選擇：
(1)許多膠体是乾燥粉末，使用前要先行膨潤，如 Sephadex, Bio-Gel P；其餘如 Sephacryl, Sepharose (CL), Bio-Gel A 均為已膨潤者，直接在玻璃漏斗以緩衝液洗過即可裝填；若有需要，可以減壓幫浦抽去氣泡。注意 Sepharose 及 Bio-Gel A 不可加熱或高壓滅菌。 (2) 取決於所要分離蛋白質樣本分子量的大小，並且預期溶離出來的蛋白質峰，可出現在 Vo-Vt 區間的前半段。 通常分子量大於十萬可用 Sepharose CL 系列，小於五萬者用 Sephadex G-100 以下，其間則使用 Sephacryl S-200 或 300。 避免使用 Sephadex G-150 或 200，因其流率不佳；其它廠牌相對應的產品，亦可使用之。 說明文字

43 ■ 膠體過濾法注意事項： (II) 樣品處理：体積限定在膠柱体積的 1-3%。有 adaptor 的管柱較方便，可用幫浦注入，否則要直接把樣品加在膠体表面上。吸去上方緩衝液後，小心注入 (乾式)；或不吸去緩衝液，把密度較大的樣本，在緩衝液中直接加入，讓它自動沉降在膠体表面 (溼式)。樣品溶液不可有沉澱，否則要先離心除去之，太濃或太稀均不適宜。 注入樣品應極為小心，勿破壞膠体表面！ 說明文字

44 ■ 膠體過濾法注意事項： (III) 管柱大小：視所要分離樣本的体積而定，一支膠体体積為 100 mL 的管柱，可分離 1-3 mL 樣本。 膠体過濾管柱以細長較妥，通常直徑為 1.6 或 2.6 cm，長度 cm，太長者擴散作用明顯。 (IV) 溶離速度：以直徑 1.6 或 2.6 cm 管柱而言，通常每小時流速約 30 mL 左右，較粗的管柱可加快，Sephadex G-150 或 G-200 要減慢，而 Sephacryl 溶離速度可加快一倍。 收集約定在每 2-5 mL 一分劃，但可依情況自行增減，最好使用分劃收集器，讀滴數、秒速均可；要注意勿讓膠体乾掉，也要小心收集器很容易出毛病。 說明文字

45 ■ 膠體過濾法注意事項： (V) 管柱保存： (1) 膠体暫不使用時，可在緩衝液中加 NaN3 (0.01%) 流洗 一次，關好出口。
(2) 長期不用時最好取出膠体，在玻璃漏斗中以 PBS 洗過 數個体積後，保存在 4℃中，再加數滴 NaN3 防菌。 (3) 若發覺膠体太髒，可用 0.2 M NaOH 或 NaCl 先洗過， 再以緩衝液平衡； 再度取出使用時，要注意有沒有長 霉 (黑色棉絮狀小球)，膠体有無結塊。 (4)已膨潤的膠体應貯於 4℃，但切勿貯藏在零下的溫 度， 膠体結構會破壞掉；乾粉或未尚未開封者，可貯於室 溫。 (5) 膠体外表看來都一樣，一定要標示好，以免混淆不 清； 千萬不要把兩種膠体混在一起，結果會很淒慘！ 說明文字

46 ■ General principle for column chromatography
Gel selection Make target protein elute out column earlier Bead size Finer bead has better resolution, slower flow rate Column size Use larger column size but consider practical need Column shape 實驗之前請仔細檢討並且把握住這些條件。 雖然理論的文字論述不能替代實際操作，但若能在操作之前後都有以上的考慮，則將會使成功機率大增。 其中，膠體『緊密裝填』可能是最重要的考慮因素。 Slim column for gel filtration, fat column for others Pack tightly Pack the gel tightly for better resolution Flow rate Fast flow reduces resolution, slow Sample volume Apply 1% of total gel volume for sample Juang RH (2007) EPA

47 ■ 膠體過濾法常見之問題與解決方法： (I) 管柱裝填：膠柱是否良好，可跑 Blue Dextran (Pharmacia)試之，藍色色帶應平穩地往下移動，色帶厚度會稍加寬，但不該有拖尾、變斜，甚或成為不規則亂流！ 也可用手電筒在管柱後方打光，看膠体中有無氣泡。 (II) 溶離緩衝液：流速太快會造成分離結果不好，通常是色帶拉長或呈現不規則。 緩衝液中的離子濃度有相當影響，通常不能使用蒸餾水來溶離。 樣本分子在通入膠体後不久，其緩衝液即被管柱中的緩衝液所取代； 若此二種緩衝液不同，則因離子濃度的改變，某些蛋白質可能會 鹽析 出來，沉澱在膠面。 說明文字

48 ■ 膠體過濾法常見之問題與解決方法： (III) 活性消失：有些樣本蛋白質，需要金屬離子、輔酶、輔因子等小分子，共同達成其活性，在通過管柱後，可能被排除而失去活性。 可在活性分析時補充，或可在溶離緩衝液中添加。 若回收量太低，注意膠体有無吸附現象。 (IV) 使用溫度：膠体管柱由冷房移到室溫後，會漸生成小氣泡，不能再用。由高溫處移至低溫處時，則無此問題。 緩衝液也有同樣現象，應當注意。 (V) 老舊膠柱：管柱經長期未使用，要注意有無長霉，管柱有無乾裂 (用手電筒檢查)。 使用太多次數後，膠柱最上方的表面會有沉澱或變得較髒，可稍挖去表層，再小心輕輕攪拌，使膠体表面重新沉降平整，對結果影響不大。 說明文字