连晓岚 福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液科

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1 连晓岚 福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液科
2018年全国医科院校研究生院联盟博士论坛 Pin1 inhibition exerts potent activity against acute myeloid leukemia through blocking multiple cancer-driving pathways 连晓岚 福建省血液病研究所 福建医科大学附属协和医院血液科

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3 研究背景

4 肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1 Pin1调节多种细胞过程、生长信号反应、细胞周期进程、细胞应激反应、神经元功能和免疫反应
Pin1（ Peptidyl-prolyl cis-transisomerase，肽脯氨酰顺反异构酶-1 ）是一种独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，能够识别并催化特定的丝/苏－脯氨酰（ Ser/Thr-Pro ）基序，使其构型发生转变，从而调节蛋白的功能[1]。许多信号传导通路中的关键信号分子，都具有特定的 Ser/Thr-Pro 基序，在磷酸化后能够被 Pin1 识别并调控。 Pin1调节多种细胞过程、生长信号反应、细胞周期进程、细胞应激反应、神经元功能和免疫反应 （Nature Reviews，2007）

5 Pin1 是多条致癌信号通路的关键效应分子 （Nat Rev Cancer, 2016） ）
Pin1 is the common key regulator of oncogenic signaling pathways in multiple tumor types. Available Pin1 inhibitors lack the required specificity and potency for inhibiting Pin1 function in vivo. Active Pin1 is a key target of All-transretinoic acid (ATRA)—in acute promyelocytic leukemia and breast cancer Pin1-KO mice have no obvious defects for an extended period of time.

6 Pin1异常活化导致癌基因和抑癌基因之间的平衡失调造成肿瘤的发生
（Nat Rev Cancer, 2016） Pin1的异常活化导致癌基因和抑癌基因之间的平衡失调造成肿瘤的发生，而这种失衡可能可以通过Pin1抑制恢复平衡 Pin1-KO mice have no obvious defects for an extended period of time. （Proc Natl Acad Sci U S A, 2002）

7 白血病 白血病是造血干细胞（ Hematopoietic stem cells，HSCs ）在分化、自我更新及扩增的过程中发生异常所致的一类恶性克隆性疾病。白血病发生的“二次打击模型” [9]，包括I类突变（激活信号转导途径而促进细胞增殖）和II类突变（影响转录因子而阻断造血细胞成熟）。白血病的发生发展过程需要至少两种以上细胞遗传学异常[10-12]。已知参与白血病发生发展过程的蛋白质，不仅有融合蛋白（例如 RUNX1 / ETO，CBFβ/ MYH11 和 PML/RARA 等），而且还有多种突变蛋白（例如NPM1，FLT3和C /EPBα等）。在白血病发生和复发的过程中， LSCs（ Leukemia stem cells，白血病干细胞）发挥着关键的作用，而 Wnt/β-catenin 信号传导通路活性状态与白血病干细胞的增殖及自我更新密切相关[13]。分子和细胞遗传学异常的复杂性导致了白血病的多样性、难治性及易复发性，因此，寻找基于病因学的潜在分子靶点，对于白血病的治疗具有重要意义。

8 Pin1 与白血病 Pin1 在肿瘤信号调控中涉及多环节多因子的复杂作用，提示 Pin1 可能为白血病发生及治疗的潜 在分子靶点。
Pin1 mRNA在10个恶性血液病细胞株（ K562、HL-60、U937、NB4、HEL、THP-1、Dami、Raji、6- T-CEM 及 Jurkat 细胞）中，均呈显著高表达；Pin1mRNA 在 C/EBPα 突变的 AML病人中高表达。 Pin1 能够增加 HTLV-1 Tax 癌蛋白的稳定性，促进白血病的发生；Pin1 沉默可以延缓 Eµ-myc 转基因小鼠的淋巴瘤疾病进展；Pin1 的功能状态影响恶性血液病的细胞周期、端粒酶、多种白血 病基因、 NF-κB 信号通路、 Notch3 等 Pin1 在肿瘤信号调控中涉及多环节多因子的复杂作用，提示 Pin1 可能为白血病发生及治疗的潜在分子靶点。而越来越多的临床与基础研究的证据也指向了这一点。在分别代表慢性粒细胞白血病急变期、急性原髓细胞白血病、组织细胞淋巴瘤向单核巨核细胞分化、急性早幼粒细胞白血病、急性红白血病、急性单核细胞白血病、巨核细胞白血病、Burkitt淋巴瘤及急性T淋巴细胞白血病的10个恶性血液病细胞株（ K562、HL-60、U937、NB4、HEL、THP-1、Dami、Raji、6-T-CEM 及 Jurkat 细胞）中，Pin1 mRNA 均呈显著高表达[14]。Pulikkan 等采集不同亚型的AML（Acute myeloid leukemia ，急性髓细胞白血病）病人的骨髓标本，发现 Pin1mRNA 在 AML（急性髓系白血病）病人中高表达，尤其在 C/EBPα 突变的 AML病人中表达更高[15]。Pin1 能够增加 HTLV-1 Tax 癌蛋白的稳定性，促进白血病的发生；Pin1 沉默可以延缓 Eµ-myc 转基因小鼠的淋巴瘤疾病进展[16, 17]。 Pin1 的功能状态影响恶性血液病的细胞周期、端粒酶、多种白血病基因、 NF-κB 信号通路、 Notch3 等[15, 16, 18-23]。

9 全反式维甲酸ATRA是Pin1抑制剂 （Nature Medicine 2015）

10 Pin1 是ATRA 治疗 APL 的主要药物靶点
PML / RARA fusion gene is a unique molecular marker of APL, while other types of leukemia and solid tumors do not exist PML / RARA fusion gene. Most of the acute promyelocytic leukemia cells have t (15; 17) (q22; q21) cytogenetic abnormalities, the formation of PML / RARA fusion gene. Degradation of PML / RARA fusion protein and removal of leukemic stem cells is necessary for the treatment of APL, and one of the mechanisms by which ATRA is capable of treating APL is to down-regulate its downstream PML / RARA fusion protein by interfering with Pin1; another important mechanism is that ATRA can directly The LBD-AF2 binding in the RARA portion of the PML / RARA fusion protein is altered to conformation, which in turn degrades the PML / RARA fusion protein [43]. Pin1 is generally highly expressed in most leukemias and solid tumors, so increasing the Pin1 inhibitory capacity of ATRA may increase its broad-spectrum antitumor activity. The retinoic acid derivatives RARs or RXRs that enhance their ability to activate RAR or RXR (retinoic acid X receptor) also did not show a stronger anti-tumor effect （Nat Rev Cancer, 2016） （Nature Medicine 2015）

11 研究方法与结果

12 Pin1在急性髓细胞白血病(AML)病人及细胞株中高表达
我们发现Pin1mRNA及蛋白在AML病人及细胞株中均高表达

13 Pin1下调细胞株的建立 plKO shRNA Tet-on 多西环素诱导表达 系统 慢病毒转染白血病细胞 嘌呤和或 G418 筛选
挑单克隆 Western Blot 验证沉默及敲除效果

14 Wnt/β-catenin、PI3K-AKT等
Pin1 功能与机制的技术路线图 细胞增殖 生长曲线 集落形成 皮下移植瘤 Wnt/β-catenin、PI3K-AKT等 多途径的癌症信传导通路 Pin1 沉默 功能 可能机制 肿瘤 蛋白检测

15 Pin1基因敲减抑制AML细胞的增殖

16 下调 Pin1 抑制AML的增殖及致瘤性

17 下调 Pin1 可调节多条癌症信号传导通路中的关键蛋白
我们前期研究发现，不论是通过沉默Pin1基因还是使用Pin1抑制剂下调Pin1均可调节多条癌症信号传导通路中的关键蛋白， 抑制AML细胞的增殖及致瘤性

18 Pin1抑制剂ATRA可调节多条癌症信号传导通路中的关键蛋白

19 ATRA抑制AML的增殖及致瘤性

20 讨论

21 Pin1 在白血病细胞中高表达 下调 Pin1 可调节多条癌症信号传导通路中的关键蛋白，抑制白血病细胞的增殖及致瘤性 Pin1 可能成为白血病的治疗靶点之一 未来，我们也将使用 Pin1 基因敲除的小鼠及携带表达白血病融合基因的逆转录病毒，研究Pin1 基因对白血病干细胞的功能及致病能力的影响。 寻找药物靶点进行基础研究的最终目的是开发新药，服务于临床， Pin1 抑制剂可能用于不同类 型白血病的治疗

22 谢谢！

23 Acknowledgements Lu Lab Chen Lab Kun Ping Lu Yuanzhong Chen
Shingo Konzodo Yu-Min Lin Asami Kondo Morris Nechama Onder Albayram Yusuke Kawabata Chenyu-Tcai Chenyu Li Chen Lab Yuanzhong Chen Yong Wu Xin Li Xiaohong Yuan Min Tan Jia Lin Yiping Huang Bixin Wang First, I’d like to thank our collaborators, mat and mindy in NIH. And to all the members of KPL lab and Zhou lab for their kind full support.

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