利用单倍体胚胎干细胞构建基因敲入小鼠.

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1 利用单倍体胚胎干细胞构建基因敲入小鼠

2 Background DBA*B6 ♀F1 ♀ Zhong et al., 2015, Cell Stem Cell

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4 适用情况 1、点突变小鼠 2、大片段KI小鼠：如在目的基因前后插入Flag、GFP等 3、条件性敲除小鼠
4、条件性过表达小鼠：Rosa26系统

5 流程 构建质粒：sgRNA（单质粒系统 mcherry，需测试KO效率）和重组质粒模板（PBKS载体），1~2周；
细胞的转染、挑单克隆及鉴定：测序鉴定，3-4周； 显微注射：发育到二细胞的进行移植，获取小鼠，时长4-5周； 鉴定小鼠，1周； 配对保种，部分使用IVF（体外受精）技术快速扩繁； 条件允许，可以持续与C57BL/6J小鼠杂交几代纯化背景。

6 流程 sgRNA（单质粒系统 mcherry，需测试KO效率，同时设计4条进行测试）、重组质粒模板（PBKS载体）和测序引物，3周
1、质粒构建 sgRNA（单质粒系统 mcherry，需测试KO效率，同时设计4条进行测试）、重组质粒模板（PBKS载体）和测序引物，3周 负责人：课题组/转基因平台 2、细胞转染、挑单克隆及鉴定 3-4周 负责人：细胞构建：转基因平台 3、显微注射 发育到二细胞的进行移植，获取小鼠，4-5周 负责人：转基因平台

7 配对保种，部分使用IVF（体外受精）技术快速扩繁 负责人：转基因平台/课题组
4、鉴定小鼠 1周 负责人：课题组/转基因平台 5、保种与扩繁 配对保种，部分使用IVF（体外受精）技术快速扩繁 负责人：转基因平台/课题组 6、纯化背景 条件允许，可以持续与C57BL/6J小鼠杂交几代纯化背景 负责人：课题组

8 质粒设计：sgRNA 目的基因 Mutant site gRNA
gRNA的位置要在突变点左右12bp以内为宜，切点越靠近突变点效率越高。gRNA应尽量选择评分高的。 gRNA构建完毕后应测试KO效率

9 质粒设计：sgRNA gRNA gRNA Mutant site
若突变点左右12bp以内没有合适的gRNA，则在突变点左右至少稍远位置各设计两条gRNA gRNA应尽量选择评分高的。 gRNA构建完毕后应测试KO效率

10 质粒设计-重组模板 Mutant site Left arm right arm 同源臂为突变点左右各1000bp左右。
1Kb左右 1Kb左右 同源臂为突变点左右各1000bp左右。 除了目的突变点外还需在sgRNA的NGG和切点位置设计同义突变。设计同义突变时应避开稀有密码子

11 质粒设计-重组模板-条件性敲除小鼠模板 质粒设计-重组模板 利用LoxP-CRE 系统在小鼠内特异性敲除特定基因

12 质粒设计-重组模板-条件性敲除小鼠模板 intron extron intron Left arm Right arm
loxp loxp Right arm 1Kb左右 1Kb左右 gRNA-1 gRNA-2 1、要保证没有cre切的时候基因型为WT，没有被破坏。 2、 Loxp要设计在intron上，最好不改变intron的长度，直接将intron的一段替换为loxp序列，一般将gRNA所在位置的序列替换为loxp序列。 3、为避免影响extron的正常情况下的剪切和拼接，loxp需距离extron 100bp-200bp。 4、extron应选择第一个或已知功能域所在extron，若为第一个extron，loxp位置则需避开转录起始位点等。

13 LIC两段连 PCR 桥连 可用prime star GXL进行PCR (right)Linker -R (left)Linker -F
15bp (left)Linker -F 15bp (left)Linker -R (right)Linker -F Left -F right -R 25bp 25bp 25bp 25bp the left arm（1kb） loxp gene the right arm（1kb） 要挑20个左右的单克隆才会中，会有很多突变 引物要提前试 14bp (the left)gRNA (the right)gRNA 14bp 可用prime star GXL进行PCR

14 gene gGNA识别序列加右侧17bp直接替换为loxp gGNA识别序列加左侧17bp直接替换为loxp 。。。 。。。
PCR桥接的引物 LIC两段连时桥接的引物

15 质粒设计-测序引物 目的基因 Left-seq-R Left-seq-F Right-seq-R Right-seq-F Left arm
Mutant site Right arm 左臂测序引物正向应在同源臂外的基因组上设计，反向引物（用此条引物测序）在突变点后200bp左右，保证测序的准确性。右臂设计同理。点突变只用一臂的引物，condition的左右臂均需测序。 引物要提前试，可用 进行设计

16 Rosa26 小鼠构建 Chu et al. BMC Biotechnology (2016)

17 用ASCI酶切，LIC把目的基因连进去。

18 Rosa26是一个安全位点，在这个位点插入序列不会影响其它基因的表达。
CMV启动子后面有一段两端带有Loxp位点的终止子，只有把这段序列切掉，CMV 才能启动后面基因的表达。

19 Thank you！