微生物学 第七章 微生物的遗传变异和育种 复旦大学 2018-11-27.

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1 微生物学 第七章 微生物的遗传变异和育种 复旦大学

2 表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。 遗传： 变异： 遗传型 + 环境条件→→→→生长发育 →→→→形态等生物学特征的总和 亲代与子代相似
亲代与子代、子代间不同个体不完全相同 遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一 遗传型： 生物的全部遗传因子及基因 遗传型 + 环境条件→→→→生长发育 →→→→形态等生物学特征的总和 表型（表现型）： 表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。

3 橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。 表型的差异只与环境有关，只在转录、翻译水平的表型变化 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为
表型饰变： 表型的差异只与环境有关，只在转录、翻译水平的表型变化 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为 橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。 遗传型变异（基因变异、基因突变）： 遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为 ）

4 放射土壤杆菌 诺卡氏菌属 蛋白胨琼脂 脑心浸出液琼脂 球形节杆菌 完全培养基 少生物素 的培养基-- 少细胞壁
Arthrobacter globiformis球形节杆菌 球形节杆菌 完全培养基 少生物素 的培养基-- 少细胞壁

5 微生物是遗传学研究中的明星（模式生物）：
微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。 微生物遗传学的意义：促进遗传学向分子水平发展，促进生化、 分子生物学和生物工程学发展、促进育种工作、 人类（微生物）基因组测序、 2015年，美国人类联合微生物组研究计划

6 第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变和诱变育种 第三节 基因重组和杂交育种 第四节 基因工程 第五节 菌种保藏
第一节 遗传变异的物质基础 三个经典实验的原理与方法 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式 原核生物的质粒 第二节 基因突变和诱变育种 基因突变的规律 突变与育种 第三节 基因重组和杂交育种 三种基因水平转移方式及其应用 第四节 基因工程 第五节 菌种保藏 微生物菌种保藏的基本方法

7 第一节 遗传变异的物质基础 关于遗传物质的争论：
第一节 遗传变异的物质基础 关于遗传物质的争论： 种质连续理论： 年间Weismann提出：生物体的物 质分为体质和种质，认为种质具有稳定性和遗传性，是一种 具有特定分子结构的化合物。 基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt Morgan）发现了染 色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说 ，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。什么 是遗传物质？ 魏斯曼(August, 德国生物学家); [例句]Based on experiments with mice, Weismann proposed that hereditary information in gametes transmitted traits to progeny. 基于小鼠实验，维丝曼提出遗传信息储存在配子中并将遗传信息传递给后代。 魏斯曼(1834～1914)，Weismann，August，德国动物学家 。1834 年1月17日生于法兰克福 ，1914年11月5日卒于弗赖堡 。1856年入格丁根大学学医 。先后在巴登和奥地利当过军医和私人开业医生。

8 一、证明遗传物质是核酸的三个经典实验 1944年，Avery离体条件下的肺炎双球菌转化实验
1952年，Hershey和Chase 噬菌体感染实验 1957年，H.Fraenkel-Conrat烟草花叶病毒重建实验

9 （一）经典转化实验 最早进行转化（transformation）实验的是F. Griffith（1928年），以Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。 光滑型（S） 粗糙型（R） 有荚膜 无荚膜 菌落光滑 菌落粗糙 分泌毒素 无 毒 致 病 不致病 SⅠ、SⅡ、SⅢ三个血清型 RⅠ、RⅡ、RⅢ三个血清型

10 S型 R型 （１）动物实验 加热灭菌 热死S菌＋活R菌

11 （2）细菌培养试验 （3）S型菌的无细胞抽提液试验 活Ｒ菌＋Ｓ菌的无细胞提取液 长出大量Ｒ菌和少量Ｓ菌 培养皿培养
活Ｒ菌＋Ｓ菌的无细胞提取液　　　　　　　　 培养皿培养 长出大量Ｒ菌和少量Ｓ菌 实验说明：加热杀死的S型细菌，其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达 S型荚膜性状的遗传特性。

12 1944年，O. T. Avery等从热死的S型S．pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了更为精密的转化实验。为Griffith的转化因子是DNA而不是蛋白质提供了第一证据。 O.T.Avery ( )

13 （1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等）
（2）对各组分进行转化试验

14 只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性
1950年，有人提出应给Avery授予诺贝尔奖，但当时许多科学家包括诺贝尔奖评委仍然对Avery的转化因子持有异议， 提议被搁置.

15 人们仍不相信DNA是遗传物质,这是由于： （1）因认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨基酸 的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。 而DNA分子量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为 不同种的有机体的核酸只有微小的差异。 （2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其 它物质。 （3）认为即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是 对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信 息的载体。

16 （三）植物病毒的重建实验--RNA作为遗传物质
（二）噬菌体感染实验—经典实验之二 1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验 （三）植物病毒的重建实验--RNA作为遗传物质 噬菌体转化实验成功后Avery的研究才得到广泛认同。当诺贝尔奖评选委员会准备为Avery授奖时，这位杰出的科学家已于1955年去世。由于诺贝尔奖评委们的失误，使人们对DNA的误解延长了差不多10年。

17 颁奖词：发现了病毒的复制和遗传结构，证明遗传物质是DNA而不是蛋白质
1969年诺贝尔生理学或医学奖 颁奖词：发现了病毒的复制和遗传结构，证明遗传物质是DNA而不是蛋白质 17

18 二、遗传物质在微生物细胞内存在的 部位和方式
（一）7个水平 具体内容看书p 细胞水平： （单细胞与多细胞、性细胞与体细胞和单核与多核细胞） 细胞核水平：（真核与原核、核内与核外和单核与多核等） 染色体水平：（一份染色体与多份染色体及染色体基因组的大小等） 核酸水平： （是DNA还是RNA、是复合还是露裸及是长还是短等） 基因水平： （依基因功能可分为结构基因及调控基因等） 密码子水平：（由结构密码子及起始与终止密码等） 碱基水平： （突变的最低交换单位有A, T, G, C 等）

19 原核及真核微生物基因组的基本特征 基因组（genome）： 1、概念 一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称
原核生物（如细菌），多为单倍体（在一般情况下只有一条染色体） 真核微生物，多条染色体，例如啤酒酵母有16~17条染色体。有时为双倍体

20 染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
2、微生物基因组结构的特点 1）原核生物（细菌、古生菌）的基因组 染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 基因组上遗传信息具有连续性； 功能相关的结构基因组成操纵子结构； 核糖体RNA：即rRNA，是最多的一类RNA，也是3类RNA（tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，形成肽链[1] （肽链在内质网、高尔基体作用下盘区折叠加工修饰成蛋白质，原核生物在细胞质内完成）的合成。rRNA占RNA总量的82%左右。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质合成的“装配机”。 结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 基因组的重复序列少而短； 古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、 转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。

21 典型的真核染色体结构； 重复序列多； 2、微生物基因组结构的特点 2）真核微生物（啤酒酵母）的基因组
啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。 没有明显的操纵子结构； 有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 重复序列多；

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23 √ （二） 原核生物的质粒 质粒的基本特征及类型 质粒（plasmid）： 转座因子（transposable element）：
（二） 原核生物的质粒 √ 质粒的基本特征及类型 质粒（plasmid）： 一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。 转座因子（transposable element）： 位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。 质粒和转座因子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子

24 Covalently closed circular DNA (cccDNA)
一、质粒的分子结构 1、结构 通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中； 也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb； （细菌质粒多在10kb以内）

25 一、质粒的分子结构 2、质粒的检测 提取所有胞内DNA后电镜观察； 琼脂糖凝胶电泳或超速离心后观察；
对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。 一、质粒的分子结构 2、质粒的检测 提取所有胞内DNA后电镜观察； 琼脂糖凝胶电泳或超速离心后观察； 特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。

26 一、质粒的分子结构 2、质粒的检测 提取所有胞内DNA后电镜观察； 琼脂糖凝胶电泳或超速离心后观察； 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点， 如抗药性初步判断。

27 质粒与宿主的关系： 二、质粒的主要类型 质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；
在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。

28 二、质粒的主要类型 致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid） 质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应

29 ！自身特性的体现 二、质粒的主要类型 1、致育因子(Fertility factor，F因子) 携带F质粒的菌株称为F+菌株
又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。 F因子存在形式： 1|）游离状态(F+) 2）与染色体相结合的状态 存在于细胞(Hfr)中，所以 又称之为附加体(episome)。 携带F质粒的菌株称为F+菌株 （相当于雄性），无F质粒的 菌株称为F-菌株（相当于雌性）。 有关内容在讲细菌的接合作用 （conjugation）时具体介绍

30 ！威力的体现 二、质粒的主要类型 2、抗性因子（Resistance factor，R因子）
大环质粒：脆弱类杆菌，抗克林霉素。小质粒，大肠杆菌，四环素抗性 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。 包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。 R100质粒(89kb)可使宿主对 下列药物及重金属具有抗性： 汞（mercuric ion ，mer） 四环素（tetracycline，tet ） 链霉素(Streptomycin, Str)、 磺胺(Sulfonamide, Su)、 氯霉素(Chlorampenicol, Cm) 夫西地酸（fusidic acid，fus） 并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。 脆弱类杆菌(b.fragilis）；clindamycin克林霉素

31 细菌素：能抑制或杀死近缘、甚至 同种不同株的细菌的因子（细菌蛋白）， ！同类竞争的武器 二、质粒的主要类型
3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 细菌素：能抑制或杀死近缘、甚至 同种不同株的细菌的因子（细菌蛋白）， 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素有自身免疫性［3］。

32 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
二、质粒的主要类型 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 细菌素（bacteriocin） 1.细菌产生的一种抗生代谢产物，对同源种或近似种才有拮抗作用； 2.蛋白质是主要成分； 3.有一定的作用机制（杀菌模式）； 4.由质粒控制。 细菌素（bacteriocin） 　　1.细菌产生的一种抗生代谢产物，对同源种或近似种才有拮抗作用； 　　2.蛋白质是主要成分； 　　3.有一定的作用机制（杀菌模式）； 　　4.由质粒控制。

33 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
二、质粒的主要类型 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 细菌素一般根据产生菌的种类进行命名： 大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）， 而质粒被称为Col质粒。 Enterochelin [医] 肠螯素; 几乎所有的大肠杆菌,还有许多其它的肠杆菌科,都能够产生邻苯二酚类铁结合复合物一肠菌素也被称作肠螯素。 由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。

34 某些极端嗜盐菌（古生菌）也被发现能产生具有广谱杀菌效果的嗜盐菌素（耐热、稳定）
产嗜盐菌素嗜盐古菌菌株筛选

35 4、毒性质粒（virulence plasmid）
二、质粒的主要类型 4、毒性质粒（virulence plasmid） 许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。 编码肠毒素的质粒（产毒素大肠杆菌：引起人类和动物腹泻） 编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒（苏云金杆菌） Ti质粒（根癌土壤杆菌）：双子叶植物冠瘿瘤 土壤农杆菌是一种能引起双子叶植物产生冠瘿瘤的土壤细菌，它带有一个大的质粒叫Ti质粒，它是携带细菌DNA向宿主植物基因组转化所需信息的重要片段，只有T—DNA片段才转入植物细胞的基因组。 患病植株营养吸收差、生长差，结果少，产量低、品质差。

36 ！人类的公仆 假单胞菌： 二、质粒的主要类型 5、代谢质粒（Metabolic plasmid） 环境保护方面具有重要的意义。
质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等 亦称降解质粒： 将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式， 环境保护方面具有重要的意义。 假单胞菌： 具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。

37 在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体
二、质粒的主要类型 6、隐秘质粒（cryptic plasmid） 隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 他们存在的生物学意义，目前几乎不了解。 在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体 （一般加上抗性基因）

38 高拷贝数(high copy number)质粒
二、质粒的主要类型 高拷贝数(high copy number)质粒 （每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝） ———————松弛型质粒(relaxed plasmid) 低拷贝数(low copy number)质粒 （每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝） ———————严谨型质粒(stringent plasmid) 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松弛控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至 个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。 窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制） 广宿主范围质粒(broad host range plasmid) （可以在许多种细菌中复制）

39 质粒之间的不亲和性、以及质粒拷贝数的多少、能适应的
三、质粒的不亲和性 质粒之间的不亲和性、以及质粒拷贝数的多少、能适应的 宿主范围的宽窄等特性均与质粒的复制控制类型有关，欲 了解详细内容请选参考“微生物遗传学”。

40 第二节 基因突变和诱变育种 自发突变 突变 诱变 诱变育种 灭菌处理 危害健康 （辐射、化学等的致癌作用）
第二节 基因突变和诱变育种 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为 。 自发突变 突变 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。 诱变 诱变育种 灭菌处理 危害健康 （辐射、化学等的致癌作用）

41 DNA损伤修复机制 基因突变 DNA复制→→真正的突变； 第二节 基因突变和诱变育种 损伤修复→→原来的结构； 基因突变：
第二节 基因突变和诱变育种 基因突变： 一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变 DNA损伤修复机制 基因突变 DNA复制→→真正的突变； 损伤修复→→原来的结构； 中文名称： 前突变 英文名称： premutation 定义： 当脆性X基因的CGG三核苷酸串联重复序列的拷贝数处在60至200时不致病的动态突变阶段。 应用学科： 遗传学（一级学科）；经典遗传学（二级学科） 基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。

42 ﹖ 1、特点 1）自发性 2）非对应性：突变性状与引起该突变的原因 3）稀有性 4）独立性 5）遗传和回复性 6）可诱变性
第二节 基因突变和诱变育种 一、基因突变 1、特点 ﹖ 1）自发性 2）非对应性：突变性状与引起该突变的原因 3）稀有性 4）独立性 5）遗传和回复性 6）可诱变性

43 抗性突变引起的争论和斗争 观点之一： “驯化”或“驯养”论 观点之二： 自发突变论
突变是生物对某特定环境的适应而产生的，环境正是突变的诱因，抗性性状与该环境因素相对应，这就是“定向变异”。 观点之二： 自发突变论 基因突变是自发的，即使诱发产生，其产生的性状与诱变因素间也是不对应的，即最终适应了的化学药物等不良因素并非诱变因素，而仅仅是一种用于筛选的环境而已。

44 三个经典实验 如何证明基因突变的非对应性? 变量实验、涂布实验、影印实验 2、实验证据 一、基因突变
证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！

45 变量实验（fluctuation analysis），又称波动试验或彷徨试验；
1943年，Salvador Luria and Max Delbruck（1943）根据统计学的原理设计 103/ml 103/ml 敏感于T1的Ecoli， 培养 涂T1板 抗噬菌体抗性产生并非由所抗的环境因素—T1诱导出来的，而是在接触T1之前， 在某次细胞分裂过程中自发产生的； 发生越早，抗性菌落越多；T1只是起淘汰和筛选作用

46 变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969

47 Newcombe的涂布实验（1949） √ NATURE，实验方法更简单 353/28

48 影印实验（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）
证明微生物的抗药性在未接触药物前自发产生，突变与相应的药物环境毫不相干 J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958

49 突变真的与选择压力无关吗？ 适应性突变（adaptive mutability）和高频突变（hypermutation ）
Benson S. Adaptive mutation: a general phenomenon or special case? Bioessays Jan;19(1):9-11. Review. Galitski T, Roth JR. A search for a general phenomenon of adaptive mutability. Genetics Jun;143(2): Dan I. Andersson, E. Susan Slechta, and John R. Roth Evidence That Gene Amplification Underlies Adaptive Mutability of the Bacterial lac Operon。 Science 1998 November 6; 282: Godoy VG, Fox MS. Transposon stability and a role for conjugational transfer in adaptive mutability. Proc Natl Acad Sci U S A Jun 20;97(13): Bull HJ, McKenzie GJ, Hastings PJ, Rosenberg SM. Evidence that stationary-phase hypermutation in the Escherichia coli chromosome is promoted by recombination. Genetics Apr;154(4):

50 ３、基因突变及其机制多样性 突变诱因 第二节 基因突变和诱变育种 染色体畸变：断裂、重排等 基因突变 复制错误 自发突变 化学错误
第二节 基因突变和诱变育种 ３、基因突变及其机制多样性 染色体畸变：断裂、重排等 突变诱因 碱基错配 DNA复制跳格 复制错误 化学错误 自发突变 脱嘌呤 脱氨基 氧化损伤 基因突变 放射线-----产生嘌呤二聚体 化学诱变剂 诱发突变 碱基类似物:5BU,2AP 碱基修饰物:NA,HA,烷化剂 DNA插入剂:吖啶类

51 ４、紫外线对DNA的损伤及其修复 紫外线（ultraviolet ray，UV） 第二节 基因突变和诱变育种 嘧啶（敏感性）＞嘌呤
第二节 基因突变和诱变育种 ４、紫外线对DNA的损伤及其修复 嘧啶（敏感性）＞嘌呤 紫外线（ultraviolet ray，UV） 嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物

52 1）光复活作用（photoreactivation photorestoration）
经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。 E.coli的实验 ① 对照：8×106个／mL E.coli → 100个／mL ② 试验：8×106个／mL E.coli →－－－－→2×106个／mL UV 360～490 nm UV 可见光，30 min 注 意：在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

53 使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）
DNA分子 光激活酶——光解酶 （光裂合酶，photolyase） UV照射 带有嘧啶二聚体的DNA分子 黑暗下结合 复合物 300～500 nm可见光 获得光能而激活 采用可见光 nm（占90%以上），红外光 nm（占10%以下）的综合光波进行体外照射。使之产生重要的生物效应及治疗效果。 　　细胞中线粒体对红光的吸收最大，在红光照射后，线粒体的过氧化氢酶活性增加，这样可以增加细胞的新陈代谢;使糖元含量增加，蛋白合成增加和三磷酸腺苷分解增加，从而加强细胞的新生，促进伤口和溃疡的愈合;同时也增加白血球的吞噬作用，提高机体的免疫功能。因而在临床上可以治疗多种疾病。 红光图片(5张) 释放光解酶 使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）

54 修复 直接修复 切除修复 复制后修复 双链断裂 的修复 2015年诺贝尔化学奖授予3位研究ＤＮＡ损伤与修复的科学家
DNA Pol 3'→5'外切酶活性 光复活—光裂合酶 直接修复 一般切除修复——UvrABC系统 特殊切除修复 切除修复 AP内切酶 糖基酶 GO系统- MutM,MutY,MutT 修复 Alkylation 烷化，烃化; 鸟嘌呤 guanine；； 甲基鸟嘌呤 methylguanine； Expression of O~ 6-Methylguanine-DNA Methyltransferase in breast cancer 乳腺癌组织中O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的表达。 错配修复-Dam, MutL,MutH,UvrD 重组修复-RecA SOS修复- RecA,LexA,UvrAB,UmuC,HimA 复制后修复 双链断裂 的修复 同源重组修复 非同源重组修复

55 这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化的突变型及其分离
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 基因型 表型 毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。 这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化的突变型及其分离

56 回复突变(reverse mutation或back mutation)：
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 1）营养缺陷型（auxotroph） 缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。 与营养缺陷型相关的三类遗传型个体： 　　野生型：自然界中分离的原始菌株， 　　营养缺陷型：诱变剂处理后产生 　　原养型：营养缺陷型菌株回复突变或重组后产生 回复突变(reverse mutation或back mutation)： 　突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。

57 基本培养基（ minimal medium，MM，符号为［－］）
与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 基本培养基（ minimal medium，MM，符号为［－］） 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基。 完全培养基（ CM，符号为［＋］） 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基 一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。 补充培养基（ SM，符号为［A］或［B］等） 凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。

58 ５、常见的微生物突变类型 表型判断的标准： 在基本培养基上能否生长 负选择标记 （突变株不能通过选择平板直接获得）
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段 1）营养缺陷型 表型判断的标准： 在基本培养基上能否生长 特点： 在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长 负选择标记 （突变株不能通过选择平板直接获得）

59 负筛选模拟实验

60 ５、常见的微生物突变类型 第二节 基因突变和诱变育种 基因型： 表型： 1）营养缺陷型（auxotroph） 营养缺陷型的表示方法：
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 1）营养缺陷型（auxotroph） 营养缺陷型的表示方法： 基因型： 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC （组氨酸缺陷型，大写字母C代表同一表型中不同基因的突变） 在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。 表型： 同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC

61 ５、常见的微生物突变类型 正选择标记 第二节 基因突变和诱变育种 2）抗药性突变型（resistant mutant） 特点： 表示方法：
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 2）抗药性突变型（resistant mutant） 基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。 正选择标记 （突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的 平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。） 特点： 表示方法： 所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示 strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

62 ５、常见的微生物突变类型 温度敏感突变：（temperature sensitive， ts ） ：
3）条件致死突变型（conditional lethal mutant） 在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 温度敏感突变：（temperature sensitive， ts ） ： 在高温下（原来可以生活的温度如42℃）致死的； 在低温下（如25-30℃）生活正常； 特点： 负选择标记 这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因

63 ５、常见的微生物突变类型 第二节 基因突变和诱变育种 4）形态突变型（morphological mutant） 造成形态改变的突变型
第二节 基因突变和诱变育种 ５、常见的微生物突变类型 4）形态突变型（morphological mutant） 造成形态改变的突变型 特点： 非选择性（非致死性）突变 突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。 产蛋白酶缺陷突变株的筛选 举例： 菌落颜色变化 β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与蓝色的非重组子分开。 形成芽胞缺陷菌株 细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。

64 （一）自发突变与育种 1. 从生产中育种:生产第一线易获得较优良的生产菌株
二、突变与育种 （一）自发突变与育种 从生产中育种:生产第一线易获得较优良的生产菌株 从污染噬菌体的发酵液中分离到抗噬菌体的自发突变株 2. 定向培育优良菌株是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。卡介苗的筛选 230代

65 （二）诱变育种 诱变育种 诱变 筛选 诱变育种具有重大的实践意义： 诱变育种的特点：高效（突变率）、广谱（多性状） 随机的 定向的——更重要
获得各种菌株；提高产品质量、有用代谢产物的产量等； 诱变育种的特点：高效（突变率）、广谱（多性状）

66 1. 诱变育种的基本环节

67 出发菌株 培养液 细胞或孢子悬液 诱变处理 平板分离 初筛 复筛 保藏及扩大试验 纯化，同步培养 离心，洗涤，打散 活菌计数
存活细胞计数，致死率计算 平板分离 变异率计算 初筛 复筛 保藏及扩大试验

68 2. 诱变育种几个原则 （1）选择简便有效的诱变剂 （2）挑选优良的出发菌株 （3）处理单细胞或单孢子悬液 （4）选用最适的诱变剂量
（5）充分利用复合处理的协同效应 （6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 （7）设计高效筛选方案 （8）创造新型筛选方法

69 （3）处理单细胞或单孢子悬液 因为:分散的细胞可均匀地接触诱变剂
诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法在当代的表型上反映。只有经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，这就叫表型延迟(phenotype lag）。

70 表型延迟 （phenotype lag） 用于诱变育种的细胞应尽量选用单核单细胞

71 （6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，找到形态、生理变异与产量变异两者间的相关性。 产量性状转化为与之相平行的肉眼可见的性状。快速平板检出法

72 蛋白酶水解圈 淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色） 氨基酸显色圈（菌落转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色） 抗生素抑制圈 指示菌生长圈（测定生长因子产量） 纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色） 外毒素的沉淀反应圈 均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的指标。

73

74 类突变株的筛选方法 （1）产量突变株的筛选 （2）抗药性突变株的筛选 （3）营养缺陷型突变株的筛选

75 （1）产量突变株的筛选 1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin）高产菌时所采用琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。

76 此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。
数据精确，效率高

77 梯度平板法（gradient plate）：定向筛选抗药性突变株
（2）抗药性突变株的筛选 正选择标记：（突变株可直接从抗性平板上获得——在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。） 梯度平板法（gradient plate）：定向筛选抗药性突变株 制备药物浓度梯度的平板； 涂布诱变处理后的细胞悬液； 培养---选择抗药性菌落；

78 （3）营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）的筛选---用于理论、应用、生产
诱变 淘汰野生型 检出突变株 鉴定突变株 夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法 富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法） 生长谱法

79 第二步，淘汰野生型,浓缩营养缺陷性 MM :野生型生长，缺陷型不长 菌丝过滤法 菌丝体 （过滤、离心） 孢子 抗生素法 青霉素法（细菌）
制霉菌素法（真菌） 死亡 野生型生长 缺陷型不生长 MM+青霉素/制霉菌素 幸存

80 第三步，检出缺陷型 夹层培养法----1个培养皿 限量补充培养法----1个培养皿 逐个检出法----2个培养皿 影印平板法----2个培养皿

81 夹层培养法（layer plating method）
限量补充培养法：MM + 微量CM 野生型 迅速生长，大菌落 缺陷型 营养有限，小菌落

82 逐个检出法 影印平板法

83 第四步，鉴定缺陷型 生长谱法（auxanography） 在混有供试菌的基本培养基表面，点加微量营养物

84 c）危害人类自身的健康； 第二节 基因突变和诱变育种 三、诱变剂与致癌物质——Ames试验 很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变
第二节 基因突变和诱变育种 三、诱变剂与致癌物质——Ames试验 很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变 a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种； b）对有害微生物进行控制； c）危害人类自身的健康；

85 所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性
三、诱变剂与致癌物质——Ames试验 “生物化学统一性”法则： 所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性 人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果 诱变剂共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比 超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用 90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用

86 具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率
三、诱变剂与致癌物质——Ames试验 美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验。 利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境和食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法 具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率

87 方法： 1.营养缺陷性菌　涂ＭＭ板 2.加入浸泡过测试药物的滤纸片 ３．培养，观察 1.无大量菌落生长 2.滤纸片周围有抑菌圈，其外围出现大量菌落 3.滤纸片周围出现大量菌落

88 证明Ames试验重要性的应用实例： 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，