3 其它純化或分離方法 Other purification methods

Presentation on theme: "3 其它純化或分離方法 Other purification methods"— Presentation transcript:

1 3 其它純化或分離方法 Other purification methods
1 3 其它純化或分離方法 Other purification methods 3.1 製備式電泳 Preparative electrophoresis 蛋白質色帶由原態電泳中直接切除出來 3.2 超高速離心法 Ultracentrifugation 以各種分子的沉降係數不同來進行分離 3.3 超微薄膜過濾法 Ultrafiltration 超微薄膜可以用來脫鹽及濃縮蛋白質 說明文字

2 3.1 製備式電泳膠片 Preparative gel format
2 3.1 製備式電泳膠片 Preparative gel format Use thick spacer to create larger gel volume Sample Stacking gel 1/4 Running gel 1/2 說明文字 +

3 ■ 製備式電泳操作 Detect protein band on the gel
3 ■ 製備式電泳操作 Detect protein band on the gel (1) 電泳後取出膠体 Take out gel after electrophoresis (5) 比對原膠体 兩側位置後 切出酵素 Compare and cut out the target band (2) 目標酵素可能位置？ Where is your protein band? 蛋白質濃度高時可用紫外線直接觀察 If the band contains large amount of protein, it is possible to visualize under near UV light 說明文字 (4) 進行染色或活性測定 Staining or activity assay (3) 膠片兩側各切出一條膠体 Slice out two gel strips along lateral edges

4 3.2 超高速離心 Sedimentation coefficient
4 3.2 超高速離心 Sedimentation coefficient Svedberg unit 粒子在密度梯度離心時的沈降速率 The sedimentation velocity of a particle when it is centrifuged in a density gradient Svedberg unit 分 子 量 molecular weight 分子密度 molecular density 分子組成 molecular composition 分子形狀 molecular shape 密度梯度 S 在很高的重力下，分子依照其密度的差異，會有不同的沈降速率： 超高速離心是一種較為不同的分離方式，與層析法、電泳法等所根據的分子性質，都不很一樣；大概只有超高速離心法，是依據分子的 密度 來分離的。 實際上，它有一個特別制定的單位叫 Svedberg unit (S)，用來描述分子的沈降性質；S 除了與分子密度有關外，也與分子量、分子形狀、組成等有關。 因此，分子量大的，不一定沈到最底部，例如 RNA 的分子量一般都小於 DNA，但是因為捲繞情況比 DNA 緊密，因此其沉降係數比 DNA 高很多。 另外，同一質体的三種構形 (supercoil, linear, open curcular) 雖然都有相同的分子量，但沈降速率有很大差別。

5 以超高速離心大量製備質体 Ultracentrifugation is used to prepare
5 CsCl gradient ultracentrifugation (Supercoiled) RNA Plasmid DNA (Open circular) Chromosomal DNA Protein Density Sedimentation 以超高速離心大量製備質体 Ultracentrifugation is used to prepare plasmid in large scale 說明文字 Plasmid DNA (Open circular)

6 Sedimentation Velocity Sedimentation Equilibrium
6 ■ 兩種超高速離心比較 Two ultracentrifuge types Centrifuge Sedimentation Velocity Sedimentation Equilibrium also called → Zone Centrifugation Isopycnic Equilibration Gradient formation Precast (sucrose, glycerol) During centrifugation (CsCl) Shallow gradient, lower density Steep gradient, higher density Suitable samples Similar density, different MW Similar MW, different density Protein Nucleic acid / cell organelle Centrifugation conditions Lower speed, not complete sedimented, stop at proper time Completely sediment to where the density is equilibrated, high speed, long running time 中文名稱 區帶離心法 等密度平衡離心法 表 4.1 兩種超高速離心方式的比較： 表 3.1

7 ■ 各種高速離心法比較 Comparison of centrifuges
7 ■ 各種高速離心法比較 Comparison of centrifuges High speed Ultracentrifugation Gravity Centrifugation (No density) Zone Centrifugation (Precast) Isopycnic Equilibration (CsCl gradient forming) (step-wise) Density Density Density Protein Lipids Sedimentation Sedimentation Chromosomal DNA Plasmid DNA (Open circular) (Supercoiled) RNA Density 一般的重力離心僅把 顆粒與溶液分離開來 圖 4.1  高速離心與兩種超高速離心法的比較： 樣本：多為蛋白質 密度相似、分子量不同者 樣本：多為核酸 密度不同、分子量相似者 Utilize gravity force to separate particles from the solution Sample: protein (similar density, but different in MW) Sample: nucleic acid (similar MW, but different in density) Higher density Lower density 圖 3.1

8 3.3 超微薄膜技術 Ultrafiltration technology
8 3.3 超微薄膜技術 Ultrafiltration technology 說明文字 Amicon catalogue

9 ■ 超微薄膜及逆滲透 Ultrafiltration and RO
9 ■ 超微薄膜及逆滲透 Ultrafiltration and RO RO Ultrafiltration Osmotic pressure Large molecule Salt water Pure water 孔徑極小 water Small molecule Reverse osmosis Reverse osmosis 大分子 被濃縮 Pure water 說明文字 孔徑更小 water

10 ■ 各種濃縮方法的使用範圍 Useful ranges
10 ■ 各種濃縮方法的使用範圍 Useful ranges Applications L - 1 L mL- 100 mL- 50 mL- 10 mL - 5 mL - 1 mL (1) Hallow fiber 空心管 (2) Tangential 多層側流管 Ultrafiltration (3) Stirred cell 攪拌加壓過濾 (4) Immersible 振動濃縮子 (5) Centriplus 微膜離心管 Ammonium sulfate * 硫酸銨 Lyophilization * 冷凍乾燥 Dialysis bag Other methods 透析袋 Electrophoretic 圖 4.2  各種濃縮方法的使用範圍比較： 電泳溶離 SpeedVac * 真空離心 Nitrogen blowing* 氮氣吹乾 * The salt concentration increases in the sample 圖 3.2

11 ■ 超微薄膜濃縮裝置 - Stirred cell
11 ■ 超微薄膜濃縮裝置 - Stirred cell Nitrogen pressure Sample solution Ultramembrane Concentrate 大分子 說明文字 Amicon Stirred Cells Support Filtrate 小分子