液相色谱的应用以及方法开发.

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1 液相色谱的应用以及方法开发

2 提纲： 一.HPLC的广泛应用 二.方法开发过程 一）选择HPLC检测器 二）分配色谱及选择流动相 三）方法开发的具体步骤 四）梯度洗脱方法

3 一.HPLC的广泛应用 据2004年统计，世界上化合物总数多达4700多万种 在全部有机化合物中仅有20％左右的样品适用于GC分析

4 HPLC的广泛应用 HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备
在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。

5 HPLC的应用领域 在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分 食品添加剂 污染物 碳水化合物 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸
蛋白、肽、氨基酸 食品添加剂 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素〕 维生素 污染物 霉菌（黄曲霉毒素〕 农药残留和兽药残留 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸

6 HPLC的应用领域 在兽药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 在医药研究中分析应用
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。 在兽药研究中分析应用

7 HPLC 的应用领域 在生物化学和生物工程中的应用 在精细化工分析中的应用 氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究
核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用 醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品

8 HPLC的应用领域 化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等； 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等
在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测 在无机离子分析中应用 饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析

9 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件
二.方法开发的过程 1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认 In general, development of a HPLC method often follows the steps outlined here. As you can see, choosing a detector is an important part of the method development process. Correct (or incorrect) detector selection will influence the success of the method. Limits of detection, limits of quantitation are directly influenced by the detector choice. Other factors can be indirectly influenced as well. For example, a very selective detector (MS or FLD) can minimize the need for perfect separation conditions. Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2

10 第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---
仪器制造商的文献，如Dionex,Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品

11 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求?
是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

12 分离(制备)时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性?
对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?

13 使用文献方法注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）

14 一）选择HPLC检测器 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系
但是： 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距 All HPLC detectors, regardless of design should provide the functions outlined here.

15 用于HPLC的检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型）
对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）

16 理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感
长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 A prefect detector design would provide all of the listed features. Unfortunately, no such detector exists and any detector design is forced to make compromises. As we will see throughout the presentation, knowledge of these compromises and the effects of the obtained results allow users to use detectors for their maximum benefit.

17 灵敏度：信噪比 6:1 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3
定量限（LOQ）：S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1 S Sensitivity is one of the most widely cited detector requirements. Generally speaking, most users demand detector that are highly sensitive to their compounds of interest. Many users describe sensitivity simply as the net response (or signal) of the peak (this may be height count, absorbance units, millivolts, intensity, and others). The true measure of sensitivity is better described as a ratio of the signal intensity divided by the intensity of the baseline noise. N

18 选择液相色谱的检测器 要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）
梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求

19 选择液相色谱的检测器 通用检测器 RI ELSD MS 灵敏度 ug ng pg 线性范围 104 否 103 流速敏感 是 否 是
线性范围 104 否 103 流速敏感 是 否 是 温度敏感 是 否 否 破坏性 否 是 是 选择性检测器 ABS FL EC Cond MS 灵敏度 ng pg fg pg pg 线性范围 流速敏感 否 否 是 是 是 温度敏感 否 否 是 是 是 破坏性 否 否 是 否 是 This slide outlines some of the varoius detector capabilities and would be the first step in detector selection.

20 吸光度（ UV/Vis）检测原理 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL
优点：1）对温度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脱 3） 灵敏度较高，ng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质

21 吸光度（ UV/Vis）检测的应用 大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA）

22 背景吸收的影响 实际 浓度 理想 1 吸光度 2 背景吸收 背景吸收降低了线性范围 多数流动相有紫外吸收

23 光电二极管矩阵（Photo Diode Array）
简称：PDA或DAD The diagram show the generic layout of a photo diode array detector. All of the energy from a broad spectrum lamp (or lamps) usually covering both the ultarviolet and visible wavelength range is passed through a flow cell. The light is then split into its component wavelenghts on a grating. A series of diodes measures the light intensity over the entire wavelenght range. The result is two types of data, a traditional chromatogram (time vs absorbance) at any wavelentgh in the operating range, and a spectrum (wavelength vs absorbace) at any given time point. Data collected from a PDA detector is often refered to as 3 dimensional data.

24 光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途
一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能 -色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合

25 荧光（Fluorescence）检测原理
原理：发荧光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象即荧光 优点：荧光检测器灵敏度高, pg级检测 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生

26 荧光检测器原理

27 荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素 染料
维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药 多环芳烃（PAH） 维生素 This slide show a small sampling of the compound classes that are often analyzed using FL detectors. Remember that some compounds have a native fluorescence while some may require either a pre-column or post column derivitization to provide fluorescent species. Carbamate Pesticide = Carbofuran Aflatoxin = Aflatoxin B1 PAH = Pyrene Vitamin = Vitamin A Amino Acid = Leucine +ACQ (Accutag Chemistry) 黄曲霉毒素 氨基甲酸酯类杀虫剂

28 示差折光（Refractive Index）检测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初） 通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 － 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值 R S

29 示差折光（RI ）检测 的原理 原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感
2）不能用于梯度检测 3）灵敏度低，ug级检测 返回

30 示差检测器的应用 示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测
特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化

31 二）色谱基本分类 色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为： 1.分配色谱—分配系数 *** 2.亲和色谱—亲和力
3.吸附色谱--吸附力 4.离子交换色谱—离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）--分子大小引起的体积排阻

32 分配色谱 分配色谱分为： 正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。
用得最多，约占60-70% 相对应的色谱柱： 反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等 正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基， -NH2氨基等

33 分配色谱的分离机理

34 分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱

35 流动相极性

36 流动相洗脱强度 **应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：
水< 甲醇<乙腈< 乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水” 正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇 **应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法

37 流动相的选择原则 样品易溶，且溶解度尽可能大 化学性质稳定，不损坏柱子 不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收 * 黏度低，流动性好 *
无毒或低毒，易于操作 易于从其中回收样品 易于制成高纯度，即色谱纯 废液易处理，不污染环境

38 三）方法开发的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值
调节a值改变选择性 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性 调节柱长度改变柱效及分离速度

39 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 样品： 色谱柱：C18，4.6mm×15mm
流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：1ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

40 1.改变容量因子 K’ 谱图

41 2.调节α值改变选择性 同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值 改变色谱柱

42 离子型化合物的色谱分离 离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱
离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性

43 3.离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离使样品成中性 适用于弱酸性化合物的分离
加入TFA,磷酸盐等降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内

44 离子抑制色谱实例 三甲氧基-四羟基苯甲醛，苯甲酸纳，苯甲醛，对甲氧基苯甲酸 而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。

45 离子抑制色谱的使用范围 下列情况下不能使用离子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化
可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”

46 4.离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型
季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸 烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同

47 离子对色谱的应用 抗组胺及减充血剂药物的分析

48 离子对色谱分析水溶性维生素

49 方法开发的其他因素 以上因素均影响分离度 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响
样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度

50 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速

51 四）液相色谱方法开发 梯度洗脱方法

52 在这一部分您将学习: 关于梯度洗脱过程及其优点. 如何优化梯度分离. 有关梯度分离的一些实用考虑.

53 液相色谱泵 稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围
制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑 滞后体积 梯度分析更为关注 目的：在任何情况下保持最高精度

54 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度

55 梯度洗脱的特点 优点 缩短分析时间 增加分离能力 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡
定量分析的重复性较低？

56 一般流出问题 早流出峰的分离度差. 迟流出峰的峰宽增加而峰高降低. 由于k’范围宽，所以分析时间长. 强保留组分造成柱污染. Isocratic elution is impractical if analytes have widely differing affinities for the stationary phase. 等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变.

57 梯度洗脱 - 一个解决方案 梯度洗脱 - 在分离过程中改变流动相组成. 优点 改善分离度 提高检测性能 能够分离复杂样品 缩短分析时间 降低由于强保留组分而使色谱 柱性能变差的可能性 其他应用 柱清洗 方法开发中的尝试运行 Gradient elution is best suited for reversed-phase HPLC, normal-phase HPLC with bonded polar stationary phases, and ion exchange liquid chromatography. Analytical Education Center H5929A

58 梯度运行中发生了什么? 增加有机改性剂的含量 分配转移到流动相 增加化合物的流速
Gradient elution is mainly utilized in reversed-phase and ion exchange liquid chromatography. Reversed-phase will here be used as an example. However, all statements made are also valid for ion-exchange chromatography. The gradient is formed by increasing the percentage of organic solvent. Consequently the partition between mobile and stationary phase for a compound will change. The compound will spend a larger part of its time in the mobile phase as the percentage of organic solvent increases. The linear velocity of the compound will thus increase. A compound accelerate through the column! When the compound elutes from the column it has reached a linear velocity often close to the velocity of the mobile phase. It also follows that e.g. a doubling of the column length does not cause a doubling of the migration time. The time it takes for a starting racecar to travel 200 meter is not twice the time it takes to make 100 meter. One can not assign a fixed k’ value to a compound when gradient elute is applied. k’ is the partition coefficient and changes during the elution. Calculating k’ using the formula k’=(tr-t0)/t0 is only correct during isocratic elution!

59 梯度方法开发- 优化溶剂梯度 5% 有机相 100% 从尝试运行开始 - 一个平缓的梯度 A scouting run is a convenient way to develop HPLC separations. Unlike using isocratic elution for method development, gradient elution allows the chromatographer to view both early eluting peaks and those strongly retained which might not even be seen with an isocratic elution. Use acetonitrile water for first gradient run if reversed phase. Gradient time can be determine by equation presented on following page. Bands should elute before gradient is complete. If gradient is started with 0% organic, long equilibration times can be expected. The theory is that the brush like features of the bonded phase fold in on themselves. Initial Gradient Run Adjust gradient range to minimize wasted time for a large number of compounds Increase N by increasing t or column length, decrease particle size and flow rate. 您必须确定: 有机溶剂 初始组成 梯度时间 梯度陡度 梯度形状 流速 柱长 柱重新平衡时间

60 选择梯度陡度 tG = 5 tG = 20 tG = 10 tG = 40 陡 平缓 min. 100% B 0% B 1 1 2 3 4
1 陡 1 2 3 4 min. 100% B 0% B tG = 40 tG = 20 平缓

61 梯度形状 线性 步进 %B time 凸形 凹形

62 对下列每种情况，您认为使用哪种梯度曲线能改善分离?
用步进梯度或流速梯度 线性梯度 选凹形梯度曲线 线性梯度 选凸形梯度曲线 线性梯度 Analytical Education Center

63 梯度平衡时间的影响（一） 10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复

64 梯度平衡时间的影响（二） 平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。

65 改变流速 5%/min 1 ml/min -> 5%/ml 5%/min 2.5 ml/min -> 2%/ml
Usually gradient slope is expressed as “%/min”. Gradient slope for a given column dimension is however more correctly given as “%/ml”. It is flow and not time that transport a compound down the column! An increase in flow rate consequently means an decrease in gradient slope, i.e. typically a improvement in resolution and vice versa. The change in plate number with flow rate will counteract this. The net effect is case dependent. However changes in band spacing may happen as with any alteration of gradient slope. The elution times are not very sensitive to flow rate. This is best understood by considering an simplified case: a molecule that does not migrate when the percentage of organic modifier is below 30% but when it is above 30% it move at the same velocity as the mobile phase. The gradient reaches 30% at 20 minutes. At a flow rate of 1 ml/min the compound elute at 22 minutes, i.e. it does not move for 20 minutes and the it goes through the column in two minutes. Increasing the flow rate to 2 ml/min will results in a elution volume of 21 minutes. 5%/min 2.5 ml/min -> 2%/ml

66 流出顺序变化 - 一个梯度洗脱现象 k’ 和有机改性剂百分含量之间的关系 - 等梯度条件 (n.b. k´为对数坐标) 梯度洗脱过程中的迁移
开始 迁移距离 The relation between partition coefficient and percentage organic modifier depends on molecular properties, see figure above. This can actually cause a compound to overtake another during a gradient. Analogy: in an 1/4 mile drag race a car passes its competitor half way down the race due to different engine characteristics. This is illustrated in the second diagram above. Larger molecules (e.g. proteins) tend to have a very steep k’ curves. Band spacing may change as column length is altered. Note elution times with a 10 and a 25 cm column in the diagram above. Observe the small change in migration time with column length. 保留时间 (min) 柱长 化合物 A 化合物 B 10 cm 10 cm 14.2 15.3 25 cm 17.9 18.2 25 cm

67 梯度洗脱的实际考虑 Blank run producing ghost peaks due to impure water.
对于下列应用，梯度洗脱可能不适合: 使用强保留添加剂的应用. 离子对色谱应用 在裸硅胶柱上的正相HPLC Ghost Peaks 0% MeOH 100% Blank run producing ghost peaks due to impure water.

68 正确的柱长是多少? 在允许的时间内获得最大分离: 分析时间短 - 短柱，高流速 分析时间长 - 长柱，正常流速
The trade off between flow rate, column length and time is the same for gradient elution. When separation time is a vital issue use a short column (5-15cm) and run at high flow rate. When maximal resolution is crucial it is advisable to use a long column (20-30 cm) at normal flow rate. Compounds with a very steep velocity curve (e.g. proteins) does not benefit from long columns. These compounds reaches quickly (after a few centimeter of acceleration) a k’=0 i.e. no stationary phase interaction. When applying steep gradients it is actually counter product to use a long column as the compounds reaches k’=0 (no chromatography) before leaving the column. The last part of the column then only add band broadening.

69 结论 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 观察流动相条件改变时色谱峰的移动
根据变化的方向及大小决定下一步干什么 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大 梯度洗脱有利于复杂样品的分离

70 开发液相色谱方法的考虑因素 分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑： 灵敏度 载样量
分析速度 溶剂损耗 成本 容易使用 色谱柱寿命 效率