2.4 親和層析法 Affinity chromatography

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1 2.4 親和層析法 Affinity chromatography
58 2.4 親和層析法 Affinity chromatography 原理概述 Basic principles 要有一對具有高親和性的分子 親和吸著劑 Affinity adsorbent 有很多親和性吸著劑可利用 金屬螯合層析法 Metal chelating 利用分子與金屬的吸引力 疏水性層析法 Hydrophobic interaction 利用分子間的疏水性引力 液相分配 Liquid partition 分子在兩液相間的分配比例不同 說明文字

2 ■ 親和層析法的四項要素 Four essential factors
59 ■ 親和層析法的四項要素 Four essential factors Solid matrix = Sepharose 配 体 Ligand (A) (1) 固相擔體 (2) 專一配對 (3) 耦合反應 (4) 溶離方法 (1) Solid Matrix B 耦合反應 (3) Coupling Reaction 溶 離 Elution (4) A B B (2) Specific Binding Substance (B) B B 圖 3.9  親和層析法的各項要素： 雜 質 contaminants B B 圖 2.12

3 ■ 親和層析法的作用機理 How it works
60 ■ 親和層析法的作用機理 How it works (1) (2) (3) X B Washing Elution A A A Sample B 親和基團 配体 ligand 圖 3.8  親和層析法的作用機理： X B 固相擔体 Solid support 圖 2.11

4 * ■ 典型的親和層析操作 Typical elution pattern pH 2.05 Elution volume Protein
61 ■ 典型的親和層析操作 Typical elution pattern Elution volume Protein Activity pH 2.05 說明文字 * * 超出管柱容量

5 + + - ■ 專一性結合力量的構成因素 Specific interactions I. Conformational Match:
62 ■ 專一性結合力量的構成因素 Specific interactions I. Conformational Match: Van der waals interaction II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der Waals interaction 兩分子間因構形互補所造成的 吸引力是由凡得瓦爾力所貢獻 =O…H-N- Kd + + - 有兩大類力量，構成分子之間的專一性吸引力： 一是兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，會因為凡得瓦爾力的關係，產生專一性吸引力 (見下圖)。另一則為兩分子之間，因為某些基團間產生了二級鍵，所造成的吸引力。通常兩個分子間的專一性吸引力的形成，這兩大類力量都會有貢獻。 親和性結合力量的大小，可以用解離常數來表示，一般解離常數至少在 10-6 以上才算有足夠的親和力 (也就是說一百萬對結合分子中，只有一對會解離開來)。 Two types of forces contribute to the specific affinity between proteins

6 ■ 構 形 互 補 所 造 成 的 吸 引 力 Van der Waal interactions
63 ■ 構 形 互 補 所 造 成 的 吸 引 力 Van der Waal interactions 凡得瓦爾鍵數目夠多即足以造就親和力 非極性電子分布均勻 有時電子分布偏向一邊 -d +d vdw vdw 造成短暫耦極 引發鄰近 原子耦極 -d +d -d +d vdw 產生短暫凡得瓦爾力 -d +d 凡得瓦爾力是造成兩個互補平面之間產生專一性吸引力的主因： 凡得瓦爾力 是分子間微弱且短暫的吸引力，多發生在非極性的分子之間；雖然極性分子之間也會有凡得瓦爾吸引力，但其重要性則不若其它二級鍵。 繞在原子最外圍的電子依一定的軌道運轉，而此電子在軌道球面上的分佈通常是均勻的。當兩個原子漸漸接近時，這兩個原子上的電子會相互影響其分佈情形；若其中一個原子的電子分佈非常短暫地發生不均勻現象，則會導致短暫的偶極性產生 (d+．d-)，而這短暫的偶極性馬上誘導另一個原子上的電子，也產生電子分佈不均的現象，但偶極剛好相反 (d-．d+)。 這兩個相反的偶極，便可以產生極微弱且短暫的吸引力，即稱為凡得瓦爾力。 凡得瓦爾力的存在太短暫，因此很容易就散掉；為了達致最大的凡得瓦爾力，兩個原子核之間，要保持在一最適距離；太近則因電子相斥而減弱，太遠則電子間的吸引力又不夠。這個最適距離，即為該原子的凡得瓦爾半徑。 又因為凡得瓦爾力實在很弱，因此要集合數十個凡得瓦爾力才能發揮作用。兩個巨分子間的接面，若其上的對應原子們，每一對都能保持在凡得瓦爾半徑上，則此二巨分子便可產生相當強的親和力量；這只有當兩個巨分子間的接觸面，剛好成為積木般的互補形狀時，才能達成。這種巨分子間的親和力，造就了非常多的細胞生理特性與功能，極為重要。 也有可能轉另一方向 between non-polar surfaces 可能回到原來的狀態

7 氰 基 -C N 醛 基 -HC=O 酸 基 -COOH 胺 基 -NH2 醇 基 -OH 硫醇基 -SH 醚 -O- 烷 基 -CH3
64 ■ 生化分子的反應基團 Some functional groups 氰 基 -C N ●●●●● 醛 基 -HC=O ●●● 酸 基 -COOH 胺 基 -NH2 ●● 醇 基 -OH 硫醇基 -SH ● 醚 -O- ● 細胞內的反應基團都不是很強： 有機化學裡的強烈反應基團，通常都不會出現在一般的生物分子上。像 KCN 的強反應性物質，對大部分細胞而言根本就是劇毒。最常見的都是一些中等程度的基團，如胺基或酸基等，者兩種基團也是組成胺基酸的重要反應基團，對蛋白質的性質影響極大。 雖然如此，這些中低反應性的基團，還是可以被利用來作為連接用的基團，例如胺基與酸基就可以連成胜汰鍵，是蛋白質的生合成方式。我們也可以利用這些基團，把配体耦合到擔体上去。 烷 基 -CH3 Inert The functional groups in a living cell are mild in reactivity

8 ■ 可與各種配体基團反應的介質 Pharmacia -NH2 -OH -SH 配体基團 親 和 性 介 質 反應基團 反應方式
65 ■ 可與各種配体基團反應的介質 Pharmacia 配体基團 親 和 性 介 質 反應基團 反應方式 -NH2 CNBr-activated Sepharose 4B -C≡N 直接反應 CH-Sepharose 4B 或其活化型 -COOH 加 EDC* N-OH-succinimide Epoxy-activated Sepharose 6B oxirane AH-Sepharose 4B -OH -SH Thiopropyl-Sepharose 6B -S-S-R DTT 活化 Activated Thio-Sepharose 4B -G-S-S-R 表 3.3  可與各種配体基團反應的介質： * EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl Affinity materials are designed to react with functional groups on ligands 表 2.3

9 ■ 親和性介質的反應基團 Functional groups
66 ■ 親和性介質的反應基團 Functional groups Sepharose CNBr - OH - O - C N NH2 - Protein - O - C - NH - Protein NH - O - C N CNBr activated - NH -C-C-C-C-C-C- NH2 Amino - NH -C-C-C-C-C-C- COOH Carboxylic - NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N O N-Succinimide 說明文字 - O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - C O OH Epoxy spacer arm effect

10 ■ 各種親和性介質及其專一性基團 Pharmacia 配 体 (A) 親和性分子 (B) 說 明 抗体 對應之抗原 免疫吸著劑，大多自行合成
67 ■ 各種親和性介質及其專一性基團 Pharmacia 配 体 (A) 親和性分子 (B) 說 明 抗体 對應之抗原 免疫吸著劑，大多自行合成 基質或抑制劑 對應之酵素 酵素的專一性結合 Protein A 部分 IgG 單株抗体純化 Con A 醣蛋白 對 α-D-葡萄糖、甘露糖基有專一性 Heparin 凝血蛋白等 Heparin Sepharose CL-6B Chelator (NTA)-Ni2+ His-tag 表現蛋白質 (His)6 與兩價陽離子間的親和力 Oligo (dT) mRNA Oligo (dT)-cellulose Cibacron-Blue NAD(P)+ 結合酵素 Blue Sepharose CL-6B AMP 或 ADP等 同上 5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B 單糖及其衍生物 Lectin 用來純化 lectin 表 3.4  各種親和性介質及其專一性基團： Affinity adsorbents with special affinity ligands 表 2.4

11 Ni Protein His ■ 金屬螯合層析法 Using metal-chelating affinity
68 ■ 金屬螯合層析法 Using metal-chelating affinity Tag Transition metals 過渡元素 His6 Expressed protein Solid support imidazole His Protein Ni d orbiter -O-C-C-C-O-C-C-C-N OH C-COOH 圖 3.10   一種金屬螯合層析法： elution Metal Chelate Affinity Chromatography 圖 2.13

12 ■ 親和層析法實例 Materials used in an example
69 ■ 親和層析法實例 Materials used in an example Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Chitin (solid support) O CH2OH OH NH2 NH O=CH3 Trypsin (target) glutaraldehyde CHOM (ligand, bait) 雞蛋粘多糖蛋白 Chicken ovamucoid Trypsin inhibitor 說明文字

13 ■ 以親和層析法純化 Trypsin purification
70 ■ 以親和層析法純化 Trypsin purification Disc-PAGE SDS-PAGE Chitin CHOM Trypsin A B C&D 先洗去無法吸附的雜質，再溶離下結合在固相擔体上的物質： 先把 胰蛋白脢 的 抑制劑 CHOM 結合到 固相擔体 上，當含有胰蛋白脢的樣本 (A) 通過此擔体時，胰蛋白脢會被 CHOM 抓住，而把雜質洗掉 (B)；雜質洗乾淨之後，再以很低的 pH  (2.05) 破壞其吸引力，而把胰蛋白脢溶離下來 (C & D)。因為胰蛋白脢在低 pH 下很安定，因此其活性都可以保持住，非常適用此種溶離方式。 純化結果可以用電泳來檢定，比較 A 與 B 可以發現，在 B 中有些色帶不見了 (灰色箭頭)，而這些色帶卻在 C 中出現 (深藍色箭頭)，但也多出一個色帶 (淺藍色箭頭)。若把 C 的樣本，同時以 SDS-PAGE 檢定，可以發現只出現一個色帶 (洋紅色箭頭)。請解釋以上這些結果。 以膠体電泳檢定親和層析 操作過程各步驟的樣本 Check by PAGE → A B C = D 相同的樣本卻有不同的色帶？

14 磷酸鈣陶土 ■ Hydroxyapatite 吸著劑 (Ca5(PO4)3OH)2 可選擇 NaCl 或 磷酸 等不同溶離條件
71 ■ Hydroxyapatite 吸著劑 氫氧基磷灰石 人骨的主要成分 (Ca5(PO4)3OH)2 磷酸鈣陶土 可選擇 NaCl 或 磷酸 等不同溶離條件 Elution by NaCl or phosphate gradient leads to different results 說明文字 具有非常多樣的吸附特性 有負電荷磷酸也有鈣離子 University of Liverpool, ChemTube3D (left) Bio-Rad CHT (right)

15 ■ 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area 蛋白質表面的非極性區域多寡不同 可利用來作為分離純化的手段 (HIC)
72 ■ 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area Activie site 說明文字 Superxoide dismutase (SOD) 蛋白質表面的非極性區域多寡不同 可利用來作為分離純化的手段 (HIC) Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig

16 Reversed phase chromatography (liquid-liquid)
73 ■ 疏水性及反相層析法 Hydrophobic interaction C18 = -C18H37 溶離液由極性轉成非極性 (或相反) HIC (liquid-solid) Reversed phase chromatography (liquid-liquid) Polar solvent Polar solvent Non-polar solvent + Non-polar area Polar phase Non-polar area (liquid) Hydrophobic group (solid) Polar area Using non-polar groups as a stationary phase 圖 3.11  疏水性及反相層析法原理： Using ion-exchanger C6 = -C6H13 Phenyl = -C6H6 有各種不同應用方式 最常被使用在 HPLC 圖 2.14

17 ■ Hydrophobic interaction chromatography (HIC)
74 ■ Hydrophobic interaction chromatography (HIC) BA = beta amylase 100 200 300 400 Ammonium sulfate (% sat.) 5 10 15 20 25 10 20 30 40 50 BA Protein concentration Ethylene glycol (%) 蛋白質表面 非極性區域 很小 非極性區較大 說明文字 由極性到非極性 的梯度 Elution volume (mL) Adapted from Pharmacia - Hydrophobic Interaction Chromatography