3.2 Peptide Peptide: >two amino acids, peptide link

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1 3.2 Peptide Peptide: >two amino acids, peptide link
Dipeptide：2 amino acid residues Oligopeptide ：2~10 amino acid residues Polypeptide：> 10 amino acid residues Protein：molecular weight > 10 Kd 1

2 Amino acids in Peptide or protein Amino acid residues
Insulin consists of 51 amino acids and generally is be known as protein according to biological function（shoud be polypeptide） Amino acids in Peptide or protein Amino acid residues *Average M.W of one Aa residue in protein is about 110, but 120 in Peptide 1

3 胰岛素原激活成形成胰岛素 Structure of preproinsulin (胰岛素原前体) and its conversion to insulin. 1

4 1、Peptide & Peptide bond
Amide link(酰胺键) = Peptide bond(肽键) Dewater Dipeptide 1

5 1

6 肽和肽键的形成 肽单位 肽键 肽平面 1

7 1

8 Peptide Bond 反式构型 1

9 Peptide Bond The peptide bond influences all aspects of protein structure and function. Key features: 1. Planar（酰胺平面） 2. Fairly rigid, due to partial double bond character. 3. Almost always in trans configuration. 4. Polar. Can form at least two hydrogen bonds. 5. Places restrictions on the conformation of the polypeptide chain. 1

10 A）Partial double-bond character of peptide bond
①氮原子上的孤对电子与COOH具有明显的conjugative effect(共轭作用)。 πorbital C πorbital A）Partial double-bond character of peptide bond 1

11 ②肽键中的C-N link具有部分Duoble link性质,肽键不能自由旋转
C-N nm C=N nm Length of peptide link nm 1

12 ③ 组成肽键的四个原子与之相连的两个碳原子（C1,2）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面/肽基平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）或肽单元 (peptide unit) 。 1

13 ④ 多数情况下，以Trans configuration （反式构型）存在
C N H 1

14 特例：X-Pro(X为任意其它Aa残基)肽键，可以Trans，也可以Cis，四氢吡咯环引起的空间位阻(Stereospecific blockade)消除顺式configuration优势
1

15 酰胺平面与α-碳原子二面角（ φ和ψ，构象角 ）
二面角(构象角) : 两相邻酰胺平面，以共同Cα为定点旋转. Φ和Ψ 构象角决定相邻2肽平面在空间的相对位置 Ψ : Cα-C angle of rotation (psi) Φ : Cα-N angle of rotation(旋转角度) (phi) 原则上Φ和Ψ可以在0o～180o之间变化。 1

16 主链构象角 角 角 角 由于肽键的部分双键性质，无转动自由度，所以每个肽单位仅仅能够围绕两个单键转动。 ：绕C’－N转动的角 1

17 ⑤ 二面角所决定的构象能否存在，取决于两相邻肽单位，非键合原子间的接近有无阻碍
Many of the possible conformations about an carbon between two peptide planes are forbidden because of steric crowding 1

18 C 1

19 1

20 完全伸展的多肽主链构象 Φ=00，ψ=00的多肽主链构象 酰胺平面 非键合原子接触半径 α-碳原子 侧链 酰胺平面
Φ=1800，ψ=1800 Φ=00，ψ=00 Φ=00，ψ=00的多肽主链构象 1

21 The peptide bond is rigid(刚性) and planar（平面）
b) The conformation corresponding to =1800, =1800, when the peptide is in its fully extended conformation. c) The conformation corresponding to =00, =00, which is disallowed by the steric overlap between H and O atoms of adjacent peptide planes. 1

22 二、肽链中AA的排列顺序和命名 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序(Amino acid sequence); 1

23 多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端（amino terminus)；
在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端（carboxyl terminus); 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为结束的排列顺序。 如上述五肽可表示为： Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu or S-G-Y-A-L 1

24 Structure of tetrapeptide
命名: 谷氨酰甘氨酰丙氨酰赖氨酸 1

25 三、Main chemical and physical properties of peptide(5 aspects)
1. 每种肽有其crystal(晶体)，Melting point都很高。 2. 在pH0～14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离 末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解 离的基团。 3. 每一种肽都有相应pI，计算方法与AA一致且复杂 K'1 K'2 K'3 K'4 B 2+ B+ B B- B2- pI=pK'2+ pK'3/2 1

26 4. 原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的Conjugate base(共轭碱)，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的Conjugate acid(共轭酸)。 5. 肽的化学反应： Ninhydrin reaction Sanger reaction DNS reaction Edman reaction Biuret reaction 1

27 Colour reaction of peptide
多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应，可用于多肽的Qualitation or quantitation。 如黄色反应，是由硝酸与AA的苯基（Tyr和Phe）反应生成二硝基苯衍生物而显黄色。 1

28 双缩脲反应 Cu2+ (硷性溶液) 蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物 红紫色络合物 1

29 双缩脲反应是多肽特有颜色反应;双缩脲是两分子尿素加热失去一分子NH3而得到的产物。
双缩脲与碱性硫酸铜作用，产生兰色铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。 含两个以上肽键的多肽，具双缩脲相似结构特点，能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物,肽键越多颜色越深;可作多肽定量测定及蛋白质定量测定，测定蛋白水解程度 1

30 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 3.乙醛酸反应
2.米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 3.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸 4.坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸 1

31 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍 6.茚三酮反应 灵敏度差 7.黄蛋白反应
5.福林试剂反应 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合---Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍 6.茚三酮反应 灵敏度差 7.黄蛋白反应 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应 生成黄色化合物 指甲、皮肤、毛发 8.考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高 微克/毫升 1

32 蛋白质的颜色反应 —OH N 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色
蛋白质的颜色反应 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 Trp 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin-Cioculteu反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 茚三酮反应 茚三酮 自由氨基及羧基 α-氨基酸 —OH N 1

33 蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光区（ nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。 蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm A1cm 280 260 测定范围：0.1～0.5mg/ml 1

34 四、Important peptide in nature
多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的Subunit(亚单位或亚基)。 许多小肽以游离状态存在,通常都具有特殊的生理功能，常称为Active peptide(活性肽),大多由Enzyme催化合成的。 如：胸腺肽、脑啡肽；激素类多肽（催产素、加压素（升高血压）、舒缓素）；抗生素类多肽；谷胱甘肽(glutathione, GSH)；蛇毒多肽等 1

35 2. 多肽类激素及神经肽 体内许多激素属寡肽或多肽 下丘脑分泌，可促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢) 1

36 1

37 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽
+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO Leu-脑啡肽 1

38 可与真核生物的RNA聚合酶和牢固结合
1

39 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val   L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌，含有D-Aa和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, Orn）。对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。 1

40 四肽侧链 N-乙酰葡糖胺 五肽交联桥 溶菌酶作用位点 β-1,4糖苷键 青霉素作用位点 N-乙酰胞 壁酸 肽聚糖 聚糖骨架 1

41  CH2 CH2 CH2 SH CHNH2 COOH CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH Glu(E)
Attention Cys(C) Gly(G) CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH  CH2 CH2 -Glu-Cys-Gly -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 CH2 SH  谷胱甘肽GSH—是体内重要的还原剂 1.参与体内氧化还原反应 2.作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基 酶或含Cys的蛋白质中SH还原性 防止氧化物积累 2GSH GS-SG氧化型  CHNH2 COOH Glu(E) 特别注意:是Glu -COOH参与形成肽键,不是-COOH 1

42 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，一种比 Aspartame 天冬甜剂
Sucrose甜200倍的Sweeting agent Aspartame 天冬甜剂 This compound is an artificial sweetener better known as aspartame or NutraSweet(R) 1

43 -天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯 O O NH2 CH  C  NH  CH  C  O CH3 CH2 COOH CH2  
1

44 例题： 肽键数＝氨基酸数－肽链数 1、10个氨基酸脱水缩合成一条肽链的化合物，这个化合物的名称为 ，含有 个肽键，失去 个水分子。 十肽 9
1、10个氨基酸脱水缩合成一条肽链的化合物，这个化合物的名称为 ，含有 个肽键，失去 个水分子。 十肽 9 9 2、n个氨基酸脱水缩合成一条肽链的化合物，这个化合物的名称为 ，含有 个肽键，失去 个水分子。 n肽 n-1 n-1 3、10个氨基酸脱水缩合成两条肽链，这两条肽链含有 个肽键，失去 个水分子。 8 8 4、10个氨基酸脱水缩合成三条肽链，这三条肽链含有 个肽键，失去 个水分子。 7 7 n-m 5、n个氨基酸脱水缩合成m条肽链，这m条肽链含有 个肽键，失去 个水分子。 n-m 1

45 例题： 6、假设组成蛋白质的20种氨基酸的平均分子量为128，
（1）假设一个多肽化合物，由10个氨基酸构成一条肽链，那么该多肽的分子量约为 。 1118 （2）假设一个多肽化合物，由10个氨基酸构成两条肽链，那么该多肽的分子量约为 。 1136 （3）假设一个多肽化合物，由n个氨基酸构成m条肽链，那么该多肽的分子量约为 。 128n-18（n-m） 1

46 例题： 7、假如组成多肽的每个氨基酸中，只含有一个氨基和一个羧基，那么：
（1）一个多肽化合物，由10个氨基酸构成一条肽链，那么该多肽分子中含有氨基和羧基的数目分别为 、 。 1 1 （2）一个多肽化合物，由10个氨基酸构成两条肽链，那么该多肽分子中含有氨基和羧基的数目分别为 、 。 2 2 （3）一个多肽化合物，由n个氨基酸构成m条肽链，那么该多肽分子中含有氨基和羧基的数目分别为 、 。 m m 1

47 五、Boc固相合成肽法（Boc-SPPS）自学！
重点： 功能基团保护：Aa的α-NH2和α- COOH保护,保证定向形成肽键; t-Boc Fmoc Aa side chain有关基团保护（S,T,C,H,K,D,E etc）,避免Byproduct形成 多肽链的延伸方向： 通常为-COOH端 NH2端，而Biosynthesis多肽或蛋白质其延伸方向则相反

48 Solid Phase Peptide Synthesis
Many peptides are potentially useful as pharmacological reagents, and their synthesis is of considerable commercial importance. There are three ways to obtain a peptide: (1) purification from tissue, a task often made difficult by the vanishingly low concentrations of some peptides; 1

49 (2) genetic engineering;
(3) direct chemical synthesis. Powerful techniques now make direct chemical synthesis an attractive option in many cases. In addition to commercial applications, the synthesis of specific peptide portions of larger proteins is an increasingly important tool for the study of protein structure and function. 1

50 Chemical synthesis of peptide
1953－Du Vigneaud首先用化学方法合成了催产素（Oxytocic hormone, Oxytocin，9肽）; 1963－R.Schwyzer合成了促肾上腺皮质激素(ACTH，24肽); 1965－中国科学家合成了 Bovine insulin,51肽); 1

51 1979年－矢岛治明等人用液相法成功地合成了牛胰RNase A（124肽），达到了天然RNase的水平。
80年代－以Merrifield固相合成法为基础发展起来的多肽合成仪不断得到完善、应用和商品化。 1

52 一条多肽链，124Aa残基组成，四个链内二硫键，Mr. 12600.它是测出一级结构的第一个酶分子。
牛胰核糖核酸酶（RNase） 一条多肽链，124Aa残基组成，四个链内二硫键，Mr 它是测出一级结构的第一个酶分子。 1

53 1

54 化学合成多肽首先解决的问题是： Protection of functional groups Aa的α-NH2和α- COOH要保护,保证定向形成肽键; Aa side chain有关基团要保护（S,T,C,H,K,D,E etc）,避免Byproduct形成 1

55 合成过程中要脱α-NH2保护剂;合成后所有保护剂要脱掉 Formation of Peptide linkage
Deprotection 合成过程中要脱α-NH2保护剂;合成后所有保护剂要脱掉 Formation of Peptide linkage 最常用Condensing agent(缩合剂): DCC(二环己基羰二亚胺) 1

56 t-Boc-NH-CH-COO- R 常以叔丁氧羰基或其他保护剂保护 t-Butoxycarbonyl 缩写BOC t-Boc(叔丁氧羰基)
1

57 举例:氯代甲酸三级丁酯保护α-NH2 -OH, 25oC 1

58 α-COOH的保护 常以Salt和Ester的形式加以保护 Salt作为临时性保护，常用的有钾，盐钠盐，三乙胺盐，三丁胺盐等
Ester有甲酯（OMe），乙酯(OEt)，苄酯(OBzl)，叔丁酯(OBut)等。 1

59 可用相应的保护剂加以保护(如用苄氧甲基保护Cys的SH)
侧链活泼基团的保护 -SH,-OH,-COOH,-NH2等 可用相应的保护剂加以保护(如用苄氧甲基保护Cys的SH) 在合成过程中始终要保护,只有合成完毕后才全部脱出 1

60 肽键的形成 ′ Aa1 DCC Aa1 Aa2 O ‖ ′ R-C-NH-R 二环己基脲 1

61 dicyclohexylcarbodimide (DCC)
二环己基碳二亚胺 接肽 碳二亚胺法接肽 1

62 合成多肽可分为三个步骤（三步曲）： ① Protection of α-NH2 ,α-COOH and side chain groups； ② Activation of Carboxyl group and formation of peptide link； ③ Deprotection and purification of target peptide. 多肽合成的基本原理可表示为： 1

63 树脂 C H 2 l t B oc N R 1 O - F 3 / D Resin Boc-SPPS Resin Resin Resin 1

64 Direction of synthesis
HF (脱去所有保护剂, 并将合成肽从树脂上切下 O +NH3-CH-C-N-CH-COO- + 树脂 Rb Ra Direction of synthesis Ra和Rb表示脱了保护剂的Side chain 多肽链的延伸方向通常为-COOH端 NH2端，而Biosynthesis多肽或蛋白质其延伸方向则相反 1

65 如果用 Fmoc(芴甲氧羰基)替代Boc的固相合成法叫Fmoc-SPPS Fmoc具有紫外吸收,可自动连续监控
1

66 1

67 Brief summary Average M.W of one Amino acid residue in protein is about 110, 120 in Peptide Amide link=Peptide bond peptide plane,s 5 characteristics Nomenclature of small peptide Ninhydrin reaction, Sanger reaction, DNS reaction, Edman reaction, Biuret reaction, Subunit, Active Peptide Cycle peptide GSH and GS-SG t-Boc Fmoc Boc-SPPS and Fmoc-SPPS 1

68 Brief summary Average M.W of one Amino acid residue in protein is about 110, 120 in Peptide Amide link=Peptide bond peptide plane,s 5 characteristics Nomenclature of small peptide Ninhydrin reaction, Sanger reaction, DNS reaction, Edman reaction, Biuret reaction, Subunit, Active Peptide Cycle peptide GSH and GS-SG t-Boc Fmoc Boc-SPPS and Fmoc-SPPS 1