急性髓细胞白血病的微小残留病检测 陈 苏 宁陈 苏 宁 苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所.  MRD 的概念和检测技术  AML 患者的 MRD 检测标志  AML 患者 MRD 检测的临床意义.

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1 急性髓细胞白血病的微小残留病检测 陈 苏 宁陈 苏 宁 苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所

2  MRD 的概念和检测技术  AML 患者的 MRD 检测标志  AML 患者 MRD 检测的临床意义

3  MRD 是指在白血病患者完全缓解后，体内残存少 量白血病细胞的状态  MRD 检测对于评估疾病状态、判断疗效、预测复 发、早期干预具有重要临床意义  多参数流式细胞仪和荧光定量 PCR 技术的发展显著 提高了 MRD 检测的敏感性和准确性

4 常用 MRD 检测技术及其敏感性 敏感性低

5  敏感性低  无法区别正常造血细胞和白血病细胞  价值有限 形态学检测技术

6 FISH  FISH 优点：定量、准确、形象、直观、特异性强  灵敏度约 10 -2 ~10 -3 ，不能满足临床对 MRD 检测敏 感性的要求  需要特异性的遗传学异常作为检测靶点  无法区分原始的白血病细胞与分化后的白血病细 胞：特别是 APL 和伴有 t(8;21)(q22;q22) 的 AML

7 FCM 技术  白血病细胞可出现异常的免疫表型以及细胞散射光 特征的改变  FCM 检测 MRD 的原理是对散射光异常或 “ 白血病相关 ” 表型进行检测，可同时定量测定多个参数变化  FCM 检测 MRD 的敏感性约在 10 -3 ～ 10 -4  适用范围广、操作快捷  尚未发现真正意义上的白血病细胞特异性抗原

8 实时定量 RT-PCR  在 PCR 中引入了荧光标记分子，通过监测荧光信号 的积累来观察整个循环过程，计算 PCR 产物量  保持经典 PCR 灵敏、快速的特点，克服了传统 PCR 技 术不能准确定量和假阳性污染的缺点

9 测序技术的发展为 MRD 检测 提供了潜在的新技术手段！

10 伴有 5q- 的低危 MDS 患者 TP53 基因突变  MDS 患者 TP53 突变率  低危 MDS ： 5-10% （单纯 5q- ： 0/20 ）  高危 MDS ： 10-15% （伴有 5q- 的复杂核型： 5/6, 83% ）  治疗相关 MDS ：伴有 5q-,26/34,76% ；不 伴有 5q-,8/106,7.5%  普通 Sanger 法测序，异常细胞比例 >20% ，第 二代测序技术可以轻易达到 500x 的测序深度， 提高异常克隆的检出率  来自瑞典、英国和德国的协作组采用第二代 测序技术对伴有 5q- 的 55 例低危 MDS 患者进 行了 TP53 基因突变检测 Jädersten M, et al. J Clin Oncol 2011. Sanger 测序 第二代测序技术

11  55 例 MDS 患者  IPSS ：低危 32 例；中危 -1 23 例；  伴有单纯 5q-MDS ： 50 例  RCMD （伴有 5q- 和其它染色体异常）： 4 例  伴有单纯 5q- RAEB ： 1 例  10/55 （ 18% ）的患者检出 TP53 突变, 平均突变克隆比 例 18% （ 1-54% ）  检出 TP53 突变患者向 AML 转化率高于阴性 MDS 患者  37 例来那度胺治疗， TP53 突变组来那度胺治疗后完 全细胞遗传学缓解比例低于阴性组（ 0/7 vs. 12/24) Jädersten M, et al. J Clin Oncol 2011.

12 Nat. Rev. Clin. Oncol. advance online publication 27 January 2015 NGS 检测 IGH/IGK/TCR 用于 MRD 检测， IG 和 TCR 重 排可见于 MM 、淋巴瘤、 B-ALL 和 T-ALL ，约 90% 的 B-ALL 表达 TCR 重排， 20% 的 T-ALL 有 IG 重排

13  MRD 的概念及其检测技术  AML 患者的 MRD 检测标志  AML 患者 MRD 检测的临床意义

14 一、免疫标志 二、染色体易位和融合基因 三、基因突变 四、异常表达的 AML 相关基因

15  正常造血细胞在其分化不同阶段的抗原表达受一系列 基因严密控制，在一定分化阶段哪些抗原表达及抗原 表达量的多少存在着明显的规律性  AML 细胞可出现白血病相关异常免疫表型（ LAIP ）  非同步抗原同时表达  交叉抗原同时表达  抗原表达量异常  细胞表面与胞浆内抗原同时表达  光散射信号改变等

16  FCM 检测 LAIP 作为 MRD 标志适用于 75-85 ％的 AML 和 95 ％的 ALL 患者  FCM 检测 MRD 的敏感性约在 10 -3 ～ 10 -4 ，低于 RQ- PCR 1 log ，但 >5 色的 MFC 可部分弥补这一缺陷  一些 AML 患者的 LAIP 可见于所有白血病细胞，部分 AML 的 LAIP 可仅见于部分白血病细胞  大多数情况下初诊时的 LAIP ，复发时仍可检出  LAIP 在疾病发展过程中可发生转化，导致假阴性， 应用多种抗体组合可减少假阴性

17 一、免疫标志 二、染色体易位和融合基因 三、基因突变 四、异常表达的 AML 相关基因

18 AML 常见染色体异常 t(8;21)10% t(15;17)8% inv(16)/t(16;16)5-10% 11q23 异常 3-5% 30 ％ 45 ％ 20 ％ 5％5％ 单一异常： 45% ≥2 种异常： 55% -5/5q- ； -7/7q- ；＋ 8 ； -Y ； +11 ； +13 ； +21; +22 3q26 ； del(9q) t(6;9) ； t(9;22) 等

19 Blood. 2011;117(9):2577-2584.

20 一、免疫标志 二、染色体易位和融合基因 三、基因突变 四、异常表达的 AML 相关基因

21 AML 患者常见基因突变及其预后意义

22  发生率高  在病程中稳定存在  突变集中于热点部位  目前以 NPM1 基因 A 型突变最为常用 基因突变在 MRD 检测中应用的要求

23 PHF6 基因突变类型 Haematologica. 2011;96:1808-14.

24 NPM1 基因突变类型 Blood. 2011;117(9):2577-2584.

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26 一、免疫标志 二、染色体易位和融合基因 三、基因突变 四、异常表达的 AML 相关基因

27 异常表达的 AML 相关基因及其预后意义

28 Blood. 2011;117(9):2577-2584.

29  MRD 的概念及其检测技术  AML 患者的 MRD 检测标志  AML 患者 MRD 检测的临床意义

30 一、 FCM 检测 LAIP 二、 RQ-PCR 检测遗传学标志

31  美国西雅图移植中心  99 例 CR1 接受同胞相合或无关供体 HSCT 的 AML 患者  移植前采用 10 色 MFC 检测骨髓标本 MRD 水平  75 例患者未检出 MRD ， 24 例患者检出不同程度 MRD  <0.01% ： 2 例  0.01%-0.1% ： 8 例  >0.1% ： 14 例  评估移植前 MRD 水平对预后的影响 HSCT 前 MRD 水平对 AML 患者预后的影响 J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.

32  2 年总生存率：移植前 MRD 阴性患者显著高于阳性 患者（ 76.6% vs 30.2% ）； 2 年 DFS (74.8% vs 9%)  2 年复发率：移植前 MRD 阴性患者显著低于阳性患 者（ 17.6% vs 64.9% ）  移植前 MRD 水平有助于提示移植预后 J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.

33  荷兰、英国多中心协作组， 94 例儿童 AML 患者  68% 的患者可检出 2 个以上 LAIP ， 26% 的患者可检出 1 个 LAIP ， 6% 的患者无 LAIP FCM 检测 LAIP 在儿童 AML 患者中的应用 Leukemia (2010) 24, 1599–1606

34 随着巩固治疗的进行， MRD 的水平呈逐渐降低的趋势 Leukemia (2010) 24, 1599–1606

35  诱导化疗后 MRD 水平可作为判断患者预后的独立因 素，不同组别 3 年无病生存期或总生存期有显著差异 Leukemia (2010) 24, 1599–1606

36 一、 FCM 检测 LAIP 二、 RQ-PCR 检测遗传学标志

37  一项 406 例 APL 的动态 RQ-PCR 检测结果显示， MRD 持续阳性 或由阴性转阳性为复发的指证  RQ-PCR 检测 PML-RARA 基因 的敏感性为 10 -3 -10 -5 ， BM 检测 的敏感性约为 PB 的 1.5 倍  MRC AML-15 方案对 APL 患者 每 3 个月进行 PML-RARA 检测， 发现复发迹象后给予砷剂，复 发率明显低于未常规进行 MRD 检测的 AML 12 方案组 RQ-PCR 检测 PML-RARA 融合基因 J Clin Oncol 2009; 27:3650–3658.

38  动态 RQ-PCR 检测结果显示， AML1-ETO 、 CBFB- MYH11 融合基因的表达水平与复发密切相关  经过巩固治疗后，在长期缓解的核心结合因子白血病 患者中，常可检测到低水平的融合基因转录  以 10 4 个 ABL1 基因拷贝作为内参照， AML1-ETO 融合 基因持续低于 10-12 个拷贝预示患者可达长期缓解 RQ-PCR 检测 AML1-ETO 、 CBFB-MYH11 对早期发现 AML 复发的意义 Blood 2010; 115:453-474

39 Ommen, H. B. et al. Blood 2010;115:198-205 RQ-PCR 检测显示，多种 AML 分子标志在血液学复发前可观察到逐 渐升高的趋势， CBFB-MYH11 克隆的倍增时间（ 36 天）长于 AML1-ETO （ 14 天）、 PML-RARA （ 12 天）、 NPM 突变（ 11 天）， 提示其克隆增殖速度和分子水平复发的变化存在较大差异， CBFB- MYH11 阳性克隆的倍增时间明显长于其他克隆

40  约 75%AML 患者可检测到 WT1 高水平表达， WT1 是 AML 患者常用的 MRD 检测标志  Cilloni 等通过系统性的分析和评估，最终选定于 WT1 基因的 5’ 端设计引物，并对正常外周血、骨髓 和 504 例 AML 患者进行了大样本研究 WT1 基因作为 MRD 标志的价值 Current Opinion in Oncology 2010, 22:656–663

41 J Clin Oncol 2009; 27:5195–5201. 标准 DA （ 7+3 ）诱导化疗后 WT1 基因表达水平下降 <2 log 的 AML 患者复发率显著升高（ p=0.004 ）， 提 示 WT1 基因可作为诱导化疗后早期评价的指标

42  PB 和 PBSC 的 WT1 基因表 达为 50/10 4 ABL 拷贝， BM 为 250/10 4 ABL 拷贝， PB 的 WT1 基因表达背景低 于 BM （ P<0.001) ，可能更 适合作为标本来源  由于 PB 和 BM 的 WT1 基因 表达背景较高，因此 WT1 更适合作为诱导化疗后早 期评价的指标，作为长期 微量 MRD 动态检测的敏感 性不高 J Clin Oncol 2009; 27:5195–5201.

43  FLT3-ITD 、 RAS 和 WT1 突变在病程中不稳定，少数 初诊时检出患者复发时突变可丢失  NPM1 基因突变在 AML 患者中检出率近 30% ， 80% 为 A 型突变，疾病进展中也较稳定，可作为 MRD 的监 测标志，敏感性可达 10 -5 ，  采用 RQ-PCR 进行的动态监测显示， 80% 血液学复发 患者在平均 97 天前检测到分子水平的复发  NPM1 突变由阴性转为阳性  或 NPM1 突变阳性的患者拷贝数上升 1 个数量级 基因突变在 AML 患者 MRD 检测中 的意义尚待积累更多的临床数据 Blood 2009, 114:2220-2231.

44  德国 - 奥地利 AML 多中心协作组  RQ-RT-PCR 对 245 例伴有 NPM1 突变的 AML 患者（ 16- 60 岁）进行检测  232 例（ 91% ）患者诱导化疗后获得 CR ， 80 例患者接 受 allo-HSCT ， 146 例接受 2-3 疗程中高剂量 Ara-C 为主 方案， 19 例行 auto-HSCT NPM1 突变作为 AML 患者 MRD 标志的价值 J Clin Oncol 2011, 29:2709-2716

45  诱导化疗后， 137 例 CR 患者中， RQ-RT-PCR 检测 BM 标本 NPM1 mu 阴性的患者 2 年累计复发率显著低于阳性组（ 6.4% vs. 53%) ，总生存率亦有显著差异 J Clin Oncol 2011, 29:2709-2716

46  129 例完成巩固治疗的患者（强化疗、 allo-HSCT 或 auto- HSCT ）， RQ-RT-PCR 检测 NPM1 mu 阴性的患者 2 年累计复发 率显著低于阳性组（ 15.7% vs. 66.5%) ，总生存率亦有显著差 异（ 88% vs. 44%) J Clin Oncol 2011, 29:2709-2716

47  136 例完成巩固治疗的患者进行随访和多次 RQ-PCR 检测， 69 例（ 51% ）患者至少出现 1 次 RQ-PCR 阳性，中位随访 24.8 个 月后，其中 43 例复发；另 26 例患者持续 CR ，为阴性或 <145 拷 贝 NPM1 mu /10 4 ABL  以 200 拷贝 NPM1 mu /10 4 ABL 作为阈值，所有 >200 拷贝的 36 例 患者均出现复发，自首次出现 >200 拷贝至血液学复发的中位 时间 2.6 个月（ 0.4-23.6 ）

48 AML 患者 MRD 检测技术

49  MRD 检测是 AML 患者个体化治疗的重要依据， MFC 和 RQ- PCR 主要的检测手段  MFC ：检测 LAIP  适用范围广，敏感性略低于 RQ-PCR  病程中 LAIP 可能出现变化  RQ-PCR ：检测融合基因、基因突变、泛白血病基因  敏感性高  特异性融合基因、 NPM1 突变和 WT1  越来越多的 AML 基因突变将为 MRD 监测提供更多的标志  新一代测序技术在 MRD 检测中有潜在应用价值 结 语

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