第十章 配子与胚胎生物技术.

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1 第十章 配子与胚胎生物技术

2 第一节 动物胚胎移植 胚胎移植（embryo transfer）：将动物的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。 提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。

3 1890年英国剑桥大学Walter Heape首次获得兔胚胎移植成功。
一、胚胎移植发展历史 1890年英国剑桥大学Walter Heape首次获得兔胚胎移植成功。 20世纪30年代，在兔、大鼠和小鼠方面进行了更多的实验，成为实验生物学中研究受精、胚胎发育等问题的一个重要方法。 家畜的胚胎移植，最早是在20世纪30年代在绵羊和山羊方面进行的。

4 在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、保存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工作，取得不少进展。
20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。 近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。

5 二、胚胎移植的意义 1.充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率 2.加速品种改良，扩大良种畜群 3.诱发肉畜怀双胎，提高生产效率
4.代替种畜的引进 5.保存品种资源 6.防疫需要和克服不孕 7．是实现克隆动物等的必需手段

6 三、胚胎移植的生理学基础和原则 (一)生理学基础 1.发情后生殖器官的孕向发育 2.早期胚胎的游离状态 3.胚胎移植不存在免疫问题
4.胚胎和受体的联系 5.胚胎的遗传特性

7 (二)胚胎移植的基本原则 1.胚胎移植前后所处环境的同一性 （１）供体和受体在分类学上的相同属性 （２）动物生理上的一致性 （３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量

8 (三)胚胎移植应具备的基本条件 1.胚胎来源 2.技术条件 3.受体母畜

9 四、胚胎移植的技术程序 胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。

10 选择的供体不但应有育种上的价值，期望从它们得到很多的后代，而且生殖机能应处于较高的水平。
（一）供受体准备 选择的供体不但应有育种上的价值，期望从它们得到很多的后代，而且生殖机能应处于较高的水平。 受体母畜可选用非优良品种的个体或土种家畜但亦应具有良好的繁殖性能和健康状态，体型中上等。

11 （二）超数排卵 在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中比在自然情况下有较多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵（superovulation）。 超数排卵主要应用于牛和羊，效果明显，对于产多胎的猪意义不大。一般认为以10～20个最为理想。

12 1.母牛 在预计自然发情的前4d，即发情周期的第16天或第17天肌肉或皮下注射PMSG1500～3000IU（或同时加注HCG1000～1500IU）。另一种方式是是在周期的第10～13天（8～15天）内进行，一次肌注上述量的PMSG，隔日再注射以PGF2a。如用FSH（或FSH+LH），则连续注射3～4d，每天早晚各一次，总量为30～40mg，第一天用量可稍多，第3天的第5次注射时，同时注射PGF2a。

13 2.母羊 在周期第12天或第13天时，一次肌注（或皮下）PMSG750～1500IU。出现发情后或配种当日再肌注HCG500～750IU。也可像母牛一样在发情周期中期进行处理，在注射PMSG之后，隔日注射以PGF2a或类似物。如采用FSH，用量为10～20mg（或200～300大鼠单位）分3天6次注射之，PGF2a在第5次同时注射之。

14 （三）供体母畜的配种 超数排卵处理的母畜发情后，根据育种的需要，应选择优良公畜的精液，在适宜时间进行人工授精。为了得到较多的发育正常的胚胎，应使用活率高密度大的精液，而且将授精次数增加到2次或3次，两次间隔8～10h。

15 （四）胚胎的收集 胚胎的收集是利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲洗，并收集在器皿中。 冲洗时要考虑到配种时间、发生排卵的大致时间、胚胎的运行速度和发育阶段等因素，时间不应早于排卵后的第一天，即最早要在发生第一次卵裂之后，否则不宜辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3～8d，发育至4～8个细胞以上为宜。牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植（配种后6～8d）。

16 1.手术法收集胚胎 按照外科手术的要求，在腹部适当部位作一切口，用注射器吸取冲洗液注入输卵管或子宫角内，进行冲洗，同时观察卵巢上的排卵情况，计算排卵率。冲洗部位决定于胚胎所处位置。

17 用注射器的磨钝针头刺入子宫角顶端，注入冲洗液，然后从输卵管的伞部接取冲洗液，这种方式适用于牛、羊、兔等。

18 由伞部注入冲洗液，在子宫角上端接取。猪和马的子宫角与输卵管接合部有一活塞状结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，只能采用第二种方式。

19 从子宫角上端注入冲洗液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家畜。

20 冲洗操作，要求迅速准确，防止对伤口、生殖器官和冲洗液的污染，避免对动物有过多刺激和对生殖器官造成损伤。一般来说，术后生殖道易发生不同程度的粘连，严重时会造成不孕。这是手术法的最大缺点。冲洗之后，立即缝合伤口，宜单独饲养，注意伤口愈合情况。

21 2.非手术法收集胚胎 牛的非手术收集胚胎可利用二路式导管冲卵器，将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后导出冲洗液，外管前端连接以气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊 胀大，堵住子宫颈内口 以免冲洗液经子宫颈流 出。

22 非手术法冲取胚胎，每侧子宫角需用冲洗液100～150ml。应用非手术法冲洗收集胚胎时，只能当胚胎都进入子宫角后进行。牛、马的胚胎用非手术法收集时，一般在配种后6～8d进行。

23 3.冲洗液 现在多采用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）、布林斯特液（Brinster's medium-3）、合成输卵管液（SOF）、惠屯氏液（Whitten's medium）、海姆氏液（Ham's F-10）以及199培养液（TCM199）。它们除含各种盐类外，还含有多种有机成分，不但用于冲洗收集胚胎，还用于体外培养、冷冻保存和解冻等处理程序。

24 收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。
（五）胚胎的检查 　 收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。 正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）一般外形整齐清晰，大小较一致， 分布均匀而紧密，发育速 度与胚胎日龄相一致。

25 保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。
（六）胚胎的保存和培养 保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。 培养则是在体温条件下，于培养液中，使之继续发育。

26 放在室温条件下，胚胎只能存活10～20h。当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。
胚胎在体温环境下（37℃）的培养，有一部分可正常发育，但发育持续的时间和达到的阶段也是非常有限的，一般只能持续3～4d。 利用兔体（输卵管）进行活体内培养（保存），然后再取出移植至同种畜体内，在羊、猪、牛、马都已试验成功，经过长途运输，移植后妊娠产仔，但必须进行两次冲洗和移植的手术，降低了它的实用价值。

27 冷冻长期保存牛、绵羊、山羊的胚胎经冷冻解冻后能够存活，且移植后均可受胎产仔。
在冷冻前需先依次经过含有由低浓度到高浓度防冻剂的杜氏培养液，防冻剂的最高梯度为1.0～1.5mol/L。每种浓度中停留5～10min，在最后一种浓度中降温冷冻。胚胎冷冻时必须采取缓慢降温。由室温降至-5℃～-7℃，每分钟降1℃，在此温度下进行诱发结冰，然后按每分钟降0.3℃～0.5℃的速度降至-33℃～-38℃，此后可直接浸入液氮保存。

28 解冻时不必控制升温速度，可直接放在室温条件下（20℃～25℃）或在35℃～37℃水浴中解冻。
解冻后必须再把防冻剂清除掉。方法是使胚胎按相反的方向（由高浓度向低浓度）依次通过含有不同浓度的防冻剂的培养液，最后移至不含防冻剂的培养液中进行移植。 牛胚胎冷冻较新的一种方法是在塑料细管中进行冷冻，一端装有胚胎和冷冻培养液，另一端为蔗糖液，解冻后随即被蔗糖液稀释，以冲淡防冻剂的含量，将塑料管直接装入移植器中，然后注入子宫。

29 胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物 。
（七）胚胎的移植 胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物 。

30 1.手术法移植 在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，用注射器或移植管将胚胎注入到同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内（以胚胎发育阶段而定）。只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一块注入。

31 2.非手术移植法 牛的非手术移植，主要方式是将一只手伸入直肠，先检查黄体位于哪一侧和发育情况，然后握住子宫颈（如同人工授精操作一样），另一只手将移植管插入与黄体同侧的子宫角内，注入胚胎。

32 对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况，同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。
（八）供体和受体的术后观察 对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况，同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。 供体在下次发情时即可照常配种，或经过二、三个月再重复作为供体，收集胚胎。受体母畜术后如发情则说明未受胎，移植失败。

33 第二节 体外受精 哺乳动物精子和卵子的受精在自然情况下都是在动物生殖道内完成的，将这个生理过程在体外实验室的培养皿内进行，则称为体外受精（in vitro fertilization，IVF ）。

34 一、 发展简史 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚学者Austin分别发现了精子获能（cap acitation）现象，使动物体外受精研究进入了新纪元。 1959年张明觉在世界上首先获得了体外受精的的哺乳动物—试管兔，推动了体外受精研究工作的开展。 1978年首例人类试管婴儿路易斯·布朗（Louise Brown）诞生。

35 直到20世纪80年代，家畜的体外受精技术才取得突破，尤其是牛的体外受精技术发展迅速。
1981年Brackett等用体内成熟卵母细胞获得试管牛犊，随后Hanada等（1985）获得绵羊和山羊体外受精后代，并于1986年获得体外成熟卵母细胞体外受精的第一头犊牛。 我国学者卢克焕（1987）在爱尔兰获得全体外过程的试管牛犊。

36 二、意义 1.可以以较低的成本，大规模地批量生产各发育期的动物胚胎。 2.作为胚胎移植技术常规服务的一部分。

37 三、技术程序 体外受精包括以下步骤：卵母细胞的获取、卵母细胞成熟、精子获能、卵母细胞受精和受精后的体外胚胎培养。

38 (一)卵母细胞的获得和成熟培养 1.屠宰场卵巢 从屠宰场采集卵巢保持在30℃～35℃，运回实验室，吸取2～6mm直径的卵泡。 2.活体取卵母细胞 超声波或腹腔镜引导经阴道穿刺采卵，吸取有腔卵泡中的卵母细胞。

39 3.卵母细胞成熟培养 选择卵丘细胞完整，形态良好的卵母细胞进行成熟培养。培养条件是39℃，5%CO2，卵母细胞在培养皿液滴内培养约24h。

40 (二)体外受精 1.精子的获能处理 哺乳动物的获能方法有培养和化学诱导两种方法。 2.受精 获能的精子和成熟的卵子共培养。

41 (三)胚胎培养 体外胚胎生产中，受精卵子在培养液中停留7～8d。 主要有两类培养系统：一是含有体细胞的共培养系统，二是限定或半限定的培养系统。 牛受精卵的共培养通常是用TCM-l99或其他液体添加血清，选用的体细胞有牛颗粒细胞，输卵管上皮细胞等。整个培养系统中不用体细胞的称为半限定或限定培养系统，取决于是否使用了血清和蛋白或合成的大分子添加物 。

42 第三节 克隆技术 克隆（clongning）是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。
在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。 哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞移植两种。

43 一、 胚胎分割 胚胎分割（embryo splitting）是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。

44 （一）发展简介 Spemann在1904年最先进行蛙类2-细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双生后代。 1970年，Mullen等通过分离小鼠2-细胞胚胎卵裂球，获得同卵双生后代。 1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地进行了绵羊早期胚胎的分割。 20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术发展迅速，Willadsen等在总结前人经验的基础上，建立了系统分割方法，并运用这种方法获得绵羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的四分之一胚胎后代。

45 （二）胚胎切割技术 1.切割器具的准备 胚胎分割需要的器械有体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。 在进行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为20～30μm。切割针目前有玻璃针和微刀两种，玻璃针一般用实心玻璃拉成，微刀是用锋利的金属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成。

46 为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。
2.胚胎预处理 为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。

47 在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。
3.胚胎分割 在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎一分为二。

48 不同阶段的胚胎，切割方法略有差异： （１）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放入另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。 （２）桑椹胚和囊胚的分割对于这一阶段的胚胎，通常采用直接切割法。操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。

49 为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。
4.分割胚的培养 为提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明带中或者用琼脂包埋移入中间受体在体内或直接在体外培养。

50 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。
5.分割胚胎的保存和移植 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。 为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。

51 （三）胚胎分割技术的进展 哺乳动物的胚胎分割技术在近20年取得了较大进展，主要表现为操作方法趋于简化，效率提高。在牛的胚胎移植生产中，胚胎分割已用于提高胚胎移植的总受胎率和克服异性孪生不育。此外，胚胎分割取样已用于胚胎的性别鉴定和转基因阳性胚胎的早期选择。

52 （四）胚胎分割目前存在的问题 1.初生重低 2.遗传一致性不同 3.同卵多胎的局限性

53 二、单个卵裂球培养 单个卵裂的分离培养实质是胚胎分割的一种特殊形式。它是把哺乳动物的早期胚胎分离成单个卵裂球，再把卵裂球单独培养为正常胚胎，然后移植给受体得到克隆后代。 卵裂球的分离有两种方式，一是通过机械切割透明带，吸出卵裂球，另一种方式是用蛋白酶溶解透明带，再用细管吹打使胚胎卵裂球分离。卵裂球可放入空透明带中或者直接裸露培养。

54 三、胚胎细胞核移植 胚胎细胞核移植（embryonic cell nuclear transplantation）又称胚胎克隆，它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术。通常把提供细胞核的胚胎称核供体，接受细胞核的称受体。

55 胚胎克隆的理论基础是早期胚胎细胞具有发育全能性或多能性，即这些细胞核被移入成熟的去核卵母细胞中，在卵母细胞的转录因子作用下，基因组可重新从头开始转录和翻译，犹如受精卵的基因组启动个体发育一样。

56 （一）哺乳动物胚胎克隆的研究简介 Spemann在1983年最早提出将胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新胚胎的设想 ； 1952年Briggs和kings获得两栖动物-非洲豹蛙的胚胎克隆后代。 1975年Bromhall最早在家兔上证实哺乳动物的胚胎细胞核移植是可行的。 哺乳动物的胚胎克隆技术在20世纪80年代得到迅速发展，相继获得了小鼠、绵羊、牛、家兔、猪和山羊的克隆后代。

57 （二）胚胎克隆的操作程序 1.卵母细胞的去核 去除卵子染色体的方法目前有细管吸除法和紫外线照射法两种。前者是用微细玻璃管穿过透明带吸出第一极体和其下方的MII期染色体，后者是用紫外线破坏染色体DNA达到去核目的。

58 胚胎克隆过程中，供体核来自早期胚胎。供体核的准备实质上是把供体胚胎分散成单个卵裂球，每个卵裂球就是一个供体核。
2.供体核的准备和移植 胚胎克隆过程中，供体核来自早期胚胎。供体核的准备实质上是把供体胚胎分散成单个卵裂球，每个卵裂球就是一个供体核。

59 融合是运用一定方法将卵裂球与去核卵子融为一体，形成单细胞结构。
3.卵裂球与卵子的融合 融合是运用一定方法将卵裂球与去核卵子融为一体，形成单细胞结构。 融合方法目前用电融合法。电融合是将操作后的卵母细胞和卵裂球复合体放入电解质溶液中，在一定强度的电脉冲作用下，使卵裂球与卵子相互融合。

60 4.卵子的激活 在正常受精过程中，精子穿过透明带触及卵黄膜时，引起卵子内钙离子浓度升高，卵子细胞周期恢复，启动胚胎发育，这一现象称激活。 在胚胎克隆过程中，通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞，造成卵母细胞内外膜结构出现瞬时通道，胞质内的钙离子进入受体核区，激活细胞核，恢复细胞周期，启动胚胎发育。

61 克隆胚胎可在体外作短时间培养后，移植到体内，也可以在中间受体或体外培养到高级阶段再进行冷冻保存或胚胎移植。
5.克隆胚胎的培养 克隆胚胎可在体外作短时间培养后，移植到体内，也可以在中间受体或体外培养到高级阶段再进行冷冻保存或胚胎移植。

62 四、体细胞核移植 体细胞核移植（somatic cell nuclear transplantation）技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建新合子的生物技术。

63 （一）体细胞克隆技术研究概况 在20世纪70年代，Gurdon等用成年蛙的角质细胞和肠细胞作核供体，通过细胞核移植获得了正常蝌蚪 ； 哺乳动物体细胞克隆直到1997年才在英国爱丁堡的罗斯林研究所取得成功，Wilmut等成功地运用绵羊胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞作核供体，通过细胞核移植，获得正常羔羊。 1998年Cibelli等用胎儿成纤维细胞，Kato等用输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞，Wells等用卵丘细胞作核供体，均已获得克隆牛，Waka yama等以卵丘细胞作核供体获得克隆小鼠。

64 （二）体细胞克隆技术的关键环节 根据Camepell和Wilmut等人提出的方法，体细胞需经过血清饥饿，即细胞培养液中血清浓度由10%降为0.5%，继续培养5d左右，使细胞处于休止的G0期，再移植到去核卵母细胞的卵黄周隙中，经电融合和激活后获得克隆胚胎，移植到受体后获得克隆后代。

65 （三）体细胞克隆技术目前存在的问题 1.结果不稳定，效率低 2.后代死亡率高 3.用其他体细胞作共体的探索 4.细胞质遗传问题 5.供体细胞的保存和细胞周期的影响

66 （四）体细胞克隆技术的发展远景 克隆技术的成功将会大大提高畜牧业的生产效率，加强濒危动物的保护力度。同时，克隆与转基因技术结合将大幅度提高转基因效率，克服外源基因随机整合带来的消极影响。克隆人的胚胎与胚胎干细胞技术结合可能会解决目前人类器官修复和移植过程遇到的免疫排斥和供体不足的难题。