第四讲 抗肿瘤药物药效学 徐寒梅.

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1 第四讲 抗肿瘤药物药效学 徐寒梅

2 药效学试验方法 一、抗肿瘤药物作用机制 二、体外抗肿瘤试验 三、常规体内抗肿瘤试验：小鼠和人 四、生物反应调节剂的试验方法
五、原位移植模型抗肿瘤试验 六、抗肿瘤转移实验 七、抗肿瘤血管新生药物试验

3 一、抗肿瘤药物作用机制 （一）细胞生物学机制
抗恶性肿瘤药通过影响细胞周期的生化事件或细胞 周期调控对不同周期或时相的肿瘤细胞产生细胞毒 作用，并延缓细胞周期的时相过渡。 分为两大类： 细胞周期非特异性药物（cell cycle nonspecific agents，CCNSA） 细胞周期（时相）特异性药物（cell cycle specific agents，CCSA

4 （二）抗肿瘤作用的生化机制 1．干扰核酸生物合成 2．直接影响DNA结构与功能 3．干扰转录过程和阻止RNA合成 4．干扰蛋白质合成与功能 5．血管生成抑制剂 (三）分子靶向药物（检索、总结）

5 二、体外抗肿瘤试验 1．MTT法 【基本原理】
活细胞的线粒体中存在与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸 (NADP)相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为 不溶性的蓝紫色的甲臜（formazan），在死细胞 中此酶活性消失，MTT不被还原。溶解甲躜后可用 酶标仪在570 nm波长处检测光密度。 结果评价：抑制率=(对照组OD值－给药组OD值)/ 对照组OD值×100%。

6 2．SRB法 【基本原理】 Sulforhodamine B（SRB）是一种蛋白质结合染料， 粉红色，溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨 基酸结合，其在 nm的OD读数与细胞数 呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。 结果评价 测定对照组细胞（C）及受试药组细胞 （T）的OD值，抑制率=(对照组OD值－给药组OD 值)/对照组OD值×100%。

7 3．集落形成法 【基本原理】 克隆原细胞（clonogenetic cell）持续分裂6代或 以上时，其后代所组成的群体（集落）便含50个以 上细胞。当培养支持物中接种的细胞比较稀疏时， 每个集落彼此不接触，通过集落计数可对克隆原细 胞做定量分析，可准确反映肿瘤细胞暴露于抗肿瘤 药物后，仍能保持持续增殖分裂能力的细胞数，是 一种较灵敏的检测方法。 结果评价：集落抑制率(%) =(1－给药组集落数/对照组集落数)×100%。

8 三、常规体内抗肿瘤试验 一）、注意事项 给药方案 阳性对照 剂量设计 给药途径 常用的鼠肿瘤和人肿瘤 实验动物

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10 二）移植性肿瘤 （1）腹水瘤 :无菌条件下取荷瘤小鼠的腹 水用无菌生理盐水以适当比例稀释，给每 只小鼠腹腔内接种（1～5）×106个细胞， 一般于接种后24 h开始给药； （2）实体瘤 :皮下瘤模型是最常用的实验 模型，在无菌条件下，将肿瘤接种于小鼠 皮下，其中腋窝部是常见的接种部位。

11 三）实体瘤接种方法 1）细胞接种法 每只小鼠接种0.2 ml，接种量（5～10）×106个细胞。 2）瘤块匀浆接种法
3）瘤块接种法 用剪刀将肿瘤剪成2 mm3将瘤块送入套管针，经切口 插入小鼠背部皮下，植入瘤块。 4）荷瘤腹水接种法 无菌条件下取荷瘤小鼠的腹水用无菌生理盐水以适当比 例稀释，给每只小鼠皮下接种（1～5）×106个细胞。

12 四）评价方法 1、腹水瘤模型 生命延长率=(T－C)/C×100%。 C----对照组平均生存时间 T----给药组平均生存时间。 生命延长率大于30%，有效（有统计学意义）。

13 中位生存时间（median survival time，MST）
MST=(中间生存天数－0.5)＋(每组鼠数的中间 数－中间生存天数前死亡的鼠数)/中间生存天 数死亡的鼠数，用(T/C)%表示治疗效果。 (T/C)%=TMST /CMST×100%。 CMST----对照组MST； TMST----给药组MST。 以125%为界，(T/C)%≥125%，视为有效。

14 2、实体瘤 1）称瘤重法 肿瘤生长抑制率=(空白对照组平均瘤重－ 给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重 ×100% 抑制率(%)≥40%，有统计学意义时为有效， 并提供相应照片。

15 2）测量瘤径法 V=(1/2)×a×b2或者V=π/6×a×b×c a、b、c分别表示长宽高。两公式可任选其一。
计算出相对肿瘤体积（RTV）； RTV=Vt/V0 V 给药前测得的体积 Vt------试验进程中某介时间点测得的体积 相对肿瘤增殖率(T/C)=TRTV/CRTV×100% TRTV-----治疗组RTV CRTV-----空白对照组RTV T/C＞40%无效；T/C≤40%，有效（有统计意义）。

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17 四、生物反应调节剂的试验方法 包括体内抗肿瘤效应确证和免疫功能研究。 巨噬细胞功能测定 天然杀伤细胞活性测定 淋巴细胞转化试验
淋巴因子转化的杀伤细胞活性测定 迟发性超敏反应 体内多种细胞因子测定

18 五、原位移植模型抗肿瘤试验 【基本原理】 原位移植（orthotopic transplantation），是指将来 源于人类某种组织的肿瘤细胞或组织种植在动物的 同一脏器，如将结肠癌细胞或组织接种在小鼠的结 肠壁等。 优点：更接近临床，药物治疗有接种部位特异的依 赖性。 目前已建立：脑瘤、舌癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、 胰腺癌、肝癌、结肠癌及前列腺癌等。

19 举例：人肝癌裸鼠原位移植模型 【材料与试剂】
BALB/C-nu/nu裸小鼠，4～5周龄，雌雄各半。动 物饲养在无特定病原菌（SPF）不境。人肝癌裸鼠 原位移植瘤组织及常用手术器械。 【操作步骤】 （1）模型制备 （2）分组给药 （3）观察指标 【注意事项及评价】 （1）模型 （2）生命延长率试验

20 六、抗肿瘤转移实验-背景介绍 1、基底膜组成成分及功能 2、肿瘤生长方式与生长相关因素 3、肿瘤扩散 4、恶性肿瘤的浸润和转移机制
5、4-类水解酶参与细胞外基质的降解： (1)丝氨 酸蛋白酶(如纤溶酶原激活剂、纤溶酶)；(2)半胱氨 酸蛋白酶(如组织蛋白酶B、G、H)；(3)天冬氨酸蛋 白酶(如组织蛋白酶D)；(4)金属蛋白酶(如胶原酶等)。 6、明胶酶

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22 六、抗肿瘤转移实验 1．肿瘤细胞与基底膜成分的黏附能力测定 【基本原理】
肿瘤细胞通过膜表面受体黏附于基底膜及细胞外 基质的成纤维黏连蛋白（fibronectin，FN）、层 黏连蛋白（laminin，LN）和Ⅳ型胶原蛋白上。细 胞的黏附性能在维持细胞外形、调节细胞分裂及 运动等功能中起十分重要的作用。黏附是癌细胞 侵袭的始动步骤。高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成 分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的 同质性黏附能力则会下降。

23 2．重组基底膜侵袭实验 【基本原理】 在肿瘤转移形成过程中，肿瘤细胞侵袭基底膜是重 要环节。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质 成分，含有Laminin，Ⅳ型胶原等，铺在PVPF滤膜 上，能在培养基中重组形成与天然基底膜极为相似 的膜结构。具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可 穿过滤膜。通过统计穿过滤膜的细胞数可在体外观 察药物对肿瘤细胞侵袭能力的影响。 抑制率(%)=(对照组侵袭细胞数－给药组侵袭细胞 数)/对照组侵袭细胞数×100%

24 3．明胶酶活性的测定方法 【基本原理】 Ⅳ型胶原是基质膜的主要构成成分，明胶酶（Ⅳ 型胶原酶）是降解Ⅳ型胶原的特异的一种基质水 解酶，其活性与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。 人纤维肉瘤细胞HT-1080能分泌分子量为72 kD和 92 kD的两种明胶酶。收集细胞培养上清即可获 得。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可将这两种明胶 按分子量大小分开，显示两条负染带，根据带的 亮度和宽度可判断药物对明胶酶活性的影响，用 于抗侵袭和转移药物的作用及机理研究。

25 4．癌细胞趋化性运动能力的测定 【基本原理】 肿瘤细胞与母体瘤分离，穿越血管壁，侵袭周边 正常组织时，需要一定的运动能力。高转移的肿 瘤细胞通常具有较强的运动性。 细胞外基质成分层黏连蛋白、纤维黏连蛋白（FN） 和一些生长因子对肿瘤细胞有趋化作用，可使其 发生定向运动。 用FN作为趋化剂，诱导肿瘤细胞穿越带微孔的滤 膜。计数穿过滤膜的细胞即可定量地反映肿瘤细 胞的运动能力，以及评价药物对细胞运动性能的 影响。

26 5．B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型 【基本原理】 黑色素瘤B16是1954年发现的C57BL/6小鼠 耳根部皮肤的自发性肿瘤。此瘤株主要特点是能 够发生肺转移。B16-BL6细胞来源于B16，具有 高转移能力。 将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵 袭周围正常组织和血管，进入血液循环，到达远 处部位发生转移，称为自发性转移。 此模型可反映出侵袭→血行播散→侵袭的完 整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭和转移能 力的影响。

27 6．Lewis肺癌自发性肺转移模型 【基本原理】
Lewis肺癌是Lewis于1951年在一只C57BL/6小鼠 上发现的，为自发性肺内未分化上皮样癌。移植 瘤主要通过血行播散在肺部形成转移灶。Lewis肺 癌移植于动物皮下、肌肉、及爪垫等特定部位， 移植瘤增殖后开始侵袭周围的正常组织和血管， 继之癌细胞进入血液循环被转移到靶器官、黏附 于靶器官的血管壁上并穿出血管，癌细胞增殖成 为克隆，最后形成癌转移瘤。上述过程基本类似 于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列 步骤，故称之为癌的自发性转移模型。它可用于 癌转移机理探讨和抗癌转移药物的筛选及研究。

28 七、抗肿瘤血管新生药物试验 1．鸡胚绒毛尿囊膜 【基本原理】
观察药物对鸡胚尿囊膜局部血管新生的影响可以 用来间接地衡量药物影响肿瘤诱生新生血管或实 体瘤组织内血管生成的能力。 【结果评价】 ①不影响血管新生（－），即甲基纤维素薄片覆 盖区域血管生成正常； ②影响不明显（±），即无血管区直径不超过2 mm；③明显抑制血管新生（＋），直径达4 mm 或更多。

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30 2．大鼠动脉无血清培养微血管样结构 【基本原理】 体外定量测定新血管生成的实验模型。将大鼠主 动脉段包埋于纤维蛋白胶中，用MCDB131无血 清培养液进行体外培养，内皮细胞从动脉段切口 处向外生长，形成具有分支的微血管样结构。于 不同天数，在倒置显微镜下计数微血管样结构的 数量，即能动态、定量地反映血管生成的情况。

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32 Matrigel血管生成试验 内皮细胞迁移试验

33 思考题 1、在SFDA网站找到《细胞毒类抗肿瘤药物非临床 研究技术指导原则》，摘要出抗肿瘤药物体内外 活性试验应该遵循的原则。 2、抗肿瘤药物作用机制 3、MTT试验的原理、注意事项 4、什么是生物反应调节剂 5、抗肿瘤转移实验种类、原理

34  人与动物用药量换算 人与动物对同一药物的耐受性是 相差很大的。一般说来，动物的耐受性要比人大，也就 是单位体重的用药理动物比人要大。
可以采用人与动物的体表面积计算法来换算： 人体体表面积计算一般认为许文生氏公式（中国生理学 杂志12:327,1937）尚较适用，即： 　　体表面积（m2）=0.0061×身高（cm） ×体重(kg) 　　例：某人身高168cm，体重55kg，试计算其体表 面积。 　　解： 0.061× × =1.576m2

35 如：人的临床剂量为 X mg/kg , 换算成大鼠的剂量： 大鼠的剂量＝X mg/kg×70kg×0
如：人的临床剂量为　X mg/kg ,　换算成大鼠的剂量： 大鼠的剂量＝X mg/kg×70kg×0.018/200g＝X mg/kg×70kg×0.018/0.2kg＝6.3 X mg/kg. 这也就是说，按单位体重的剂量来算，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍。