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=== 第八章 層析法 === 第8章 層析法 8-1 層析法基本原理 8-2 氣相層析儀 8-3 液相層析儀
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8-1 層析法基本原理 應用吸附力的大小不同，作為分離混合物的層析法，稱為吸附式色層分析，其固定相通常是多孔性固體，或可稱為固體吸附劑，流動相為流體（液體或氣體）。流動相內的試樣分子並不會進入固體內，試樣分子只是在固定相的表面被固定相以吸附力吸引，當流動相流過，吸附力較小的先被帶走，滯留時間短；吸附力大的需要花較長的時間才會被流動相帶出，滯留時間長，因此可達分離之效果。
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8-1 層析法基本原理 範例 8-1
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8-1 層析法基本原理 範例 8-2
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8-1 層析法基本原理 2.紫外燈顯色：若樣品本身是可產生螢光的物質，可將濾紙放置在紫外燈光下照射，化合物會吸收紫外光而呈現黑點。
3.碘薰顯色：將碘的結晶放在廣口瓶內，放入濾紙蓋上瓶蓋，會產生暗棕色的色點。這種方法是利用有機化合物與碘形成分子錯合物而帶有顏色，但烷類及鹵化烷類除外。
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8-1 層析法基本原理 範例 8-3
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8-1 層析法基本原理 薄層層析法（thin layer chromatography, TLC）屬於吸附層析的一種。固定相為固體，移動相為液體。固定相一般稱為TLC 片。操作薄層層析法時，以毛細管將試樣溶液點在TLC 片的一端，再將TLC片放在裝有少量溶劑，亦即展開液，的玻璃瓶（展開槽）中，移動相溶劑就會因為毛細現象，開始沿TLC片往上移動，也把試樣中的化合物帶上去，試樣中的成分對固定相的吸附力不同，因此移動的速率也就不同。如圖8-6。
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8-1 層析法基本原理 如果試樣本身無顏色，可以採用與濾紙色層分析法相同的顯色方法，不過TLC 片的吸附劑分有含螢光成分與不含螢光成分兩種，通常不顯色的試樣會選用含螢光成分的TLC 片，所以在紫外光燈照射下即可顯現黑色色點。 在應用上，薄層層析法與濾紙色層分析法一樣，比較不適合用於定量分析。定量分析時，要先收集分離之試樣化合物，可於一開始便採用較厚的薄層，分離展開後，將含有分離成分的吸附劑刮下，再以適當的溶劑萃取純化，然後秤重定量，若有其他結構鑑別的需求，也可將分離成分拿去做進一步分析。
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8-1 層析法基本原理 分子篩層析法是在分離管柱填充凝膠當固定相。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固態物質，內部具有網狀篩孔，當分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，於是很快就可以流出管柱；較小的分子因為進入凝膠內的篩孔，故在管柱內的停留時間較長，因此便能將大小不同的分子分離。這種層析法常應用於推測高分子化合物的分子量，分子量越大，分子就越大，滯留時間就越短，與已知分子量的物質比較滯留時間，而推測未知試樣的分子量。一般狀況下，凝膠不會吸附成分，所有欲分離物質都會被洗出，這是凝膠層析法與其他層析法不同的地方。
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8-2 氣相層析儀 第二種：氣相-液相層析法。利用分析物在氣態移動相，以及附著於惰性固體表面上之液體固定相之間的分配作用，而予以分離。
在氣相層析法（GC）中，樣品被氣化後注射至層析管柱之前端。移動相的沖提是由於惰性氣體之流動，與其他類型之層析法最大不同之處是，移動相並不與分析物作用，因而通常需要較長的分析管柱，移動相氣體的功能僅是載動分析物流經分析管柱，稱為載流氣體。
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8-2 氣相層析儀 1 載流氣體 載流氣體必須具有化學惰性，常用者包括氮氣、氦氣、氫氣和二氧化碳等，使用何種氣體，通常視偵檢器而定，其中氦氣使用最廣。為延長儀器、管柱壽命與增加分析靈敏度，載流氣體進入儀器前，須先去除氣體中之雜質，如水分、氧氣與碳氫化合物等。
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8-2 氣相層析儀 2 注入口 注入口的最前端是一片矽膠墊片，試樣注入時通常以微量注射針穿透過矽膠墊片，進入管柱前端立即揮發，而被載流氣體攜帶，這個矽膠墊片是具有彈性的，可以容許多次的穿透而不致於漏氣，但經不斷的使用之後，仍需經常注意更換，否則使用一段 時間後會磨損而漏氣。由於試樣必須要氣化才能被攜帶，因此注入口的溫度通常設定在250 ℃以上。 試樣為固體時，需溶於揮發性溶劑中，再取少量注入即可，試樣為液時也採相同操作。有時，液體也可考慮直接注入，但如此容易造成注入過多試樣，管柱無法負荷而導致分離效果不佳。
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8-2 氣相層析儀 氣相層析儀中的GLC，其固定相為液態，為管柱內固體填充物上的液體薄膜，固體填充物亦稱為載體（support），可分為非極性、中等極性及極性三種。 非極性的載體，例如活性碳，與試樣的吸附力主要為凡得瓦力，分子量越大作用力越大，在管柱上的滯留時間也越長，而分子量與沸點成正比，因此試樣通過管柱的先後順序與試樣的沸點成反比，沸點越低者越快通過，因此這一類管柱常被稱為沸點管柱。
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8-2 氣相層析儀 管柱內的材料若為中等極性（如氧化鋁）與極性（如沸石），其和試樣的作用力就不只凡得瓦力，因此試樣通過的先後順序較難預測，通常極性高的試樣與極性固定相吸附力較大，在管柱上的滯留時間會較長。使用高極性管柱時要注意，有可能發生某些化合物吸附其上而無法被帶出。 載體本身雖很穩定，但是有些液相材料並不穩定，溫度過高時會被破壞而被載流氣體帶出，管柱就失去功能，因此使用之前必需確認管柱內的填充物可承受之極限溫度（maximum temperature）， 任何時候管柱的溫度都不得高於此溫度。
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8-2 氣相層析儀 4 加溫爐 氣相層析儀的試樣是以氣態進行分析，整個層析過程需維持在高溫狀態，操作時需依照試樣的性質設定溫度範圍，因此從注入孔到管柱都須置於加溫爐中，以確定在整個層析過程中試樣是氣態，且能得到合理的滯留時間。加溫爐的溫度是可調整的，溫度越高，氣體動能越大，試樣行進的速度也越快。提高管柱溫度有助於縮短滯留時間，但若溫度不適當，分離效果會降低。一般設定管柱溫度等於或略高於樣品的平均沸點，即可得到合理之滯留時間。而對於沸點差異大的試樣混合物進行層析時，可以使用溫度控制器的連續性或階段性升溫方式予以分離。
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8-2 氣相層析儀 2.熱導電度偵檢器（TCD）：利用不同物質之熱傳導度不同的原理，當試樣流經惠斯頓電橋時，因熱傳導度不同而產生電阻值之變化，測定其變化而得分析圖譜。惠斯頓電橋的裝置如圖8-14，在右側的電阻絲（R2）讓不含試樣的載流氣體通過，做為對照側；在左側的電阻絲（R1）則讓攜帶試樣的載流氣體通過。在固定的電壓以及固定的氣體流速下，通過兩側電阻絲的氣體若都不含試樣時，位於惠斯頓電橋中央的架橋電阻絲之中間位置可找到一零電位點。但當左側通過兩股串聯電阻絲之氣體中含有試樣時，因為氣體的導熱係數改變了，致使兩側電阻絲溫度不同，電阻產生變化，因此就改變了架橋電阻絲兩端的電位A-B，零電位點的位置產生偏動，於是訊號產生。
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8-2 氣相層析儀 以TCD當偵檢器時，偵檢器的溫度設定須比注入口與分析管柱高。除此之外，載流氣體的導熱能力也很重要。氫氣及氦氣的導熱係數大，為最理想的選擇。因大部分的有機物試樣導熱係數都不高，氫氣或氦氣與其混合時，造成的導熱係數落差會很大，故可得高靈敏度。但氫氣具危險性，氦氣則較貴，各有缺點。氮氣雖導熱係數低，卻便宜又安全，有時也會被使用。但因其導熱係數與有機物試樣相近，與有機物試樣混合後，造成的導熱係數之變化有正亦有負，所以會產生正向或負向的訊號。
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8-2 氣相層析儀 TCD 為非破壞性的偵檢器。一般而言，偵測靈敏度TCD 也不會比FID 差，且價格便宜又安全，因此用途很廣。但為保護惠斯頓電橋的電阻，TCD 一般不適合用於鹵化物的試樣；若分析管柱使用毛細管柱，因為注入試樣很少，大都還是以FID 為偵測器。
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8-2 氣相層析儀 3.電子捕獲偵檢器（ECD）：應用於以氬或氦氣為載流氣體的氣相層析。偵檢器以放射性物質放出射線（電子流），利用試樣中不同成分對電子流之影響不同，測定其電子流變化情形則得到分析圖譜。一般含鹵素之碳氫化合物常使用此種偵檢器。 4.光游離偵檢器（PID）：以紫外光使樣品分子游離帶電，再測量其游離帶電之情形以得到電子訊號，依訊號強弱得到分析圖譜。一些在火燄離子偵檢器FID 靈敏度較低之物質，以PID 測定時有很好的靈敏度，故此偵檢器逐漸普遍應用。
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8-2 氣相層析儀 5.火燄激發偵檢器（FPD）：類似火燄傳導偵檢器，以氫氣火燄將樣本中所含之磷或硫轉變為特殊型態，偵測該光譜之波長特性及強度，可得定性及定量之結果，因此一般適用於含磷或硫的試樣。 選擇偵檢器時，通常選擇對分析試樣有好的靈敏度、穩定性與再現性、對分析試樣偵測時濃度線性範圍大、有高預測性與選擇性、且對試樣沒有破壞性。
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8-2 氣相層析儀 氣相層析儀常應用於沸點低之液態或氣態有機物之定量及定性分析，如農藥的檢測或是醇類、酯類、酮類、醛類、醚類與芳香烴類等有機試樣，多以氣相層析儀分析。在環境汙染檢驗上，氣相層析儀是應用最廣的分析儀器。 操作時先依分析試樣的性質選擇適當之分析條件，例如：注入口溫度、偵檢器溫度、管柱種類、管柱溫度、載流氣體流率等。
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8-2 氣相層析儀 解析度太小，兩個峰無法徹底分離；解析度太大，分離時間需長，工作效率低。因此一般要求R>1.5，或是按照研究或分析的需求作調整。 影響解析度R 值的因素主要有三個，理論平板數、滯留因子及分離選擇性因子。
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8-2 氣相層析儀 1.渦流擴散 渦流擴散又稱多徑擴散：因為流動相分子在管柱內，所通過的路徑不同，如圖8-23，所以走的路徑長短亦不同，導致同一物質在管柱內停留的時間不同，使尖峰變寬。渦流擴散可藉由管柱填充物粒徑減小而改善，因為粒徑減小，填充物粒徑間的移動相路徑之長短差異就較小。
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8-2 氣相層析儀 3.非平衡之質量轉移 非平衡之質量轉移又稱傳質阻力。有時因為移動相的流速太快，使得試樣分子在移動相與固定相之間的平衡來不及達到，相之間的平衡無法真正實現，所造成的尖峰寬度就變寬。非平衡之質量轉移是影響液相層析管柱效率高低的最重要因素。可藉由流速的調整與填充物粒徑減小與管柱變細，盡量使相之間能達到平衡。
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8-2 氣相層析儀 氣相層析儀是在分離混合物時非常有用的工具，但是，在定性分析的部分，雖說可利用滯留時間做定性分析，鑑定推測未知試樣的成分，但只由繪出的圖譜上看到訊號，並不能夠知道其結構，因此在結構的判定上仍有賴於其他光譜分析的工具來確認。所以，一般須先知道未知試樣可能為哪幾種，例如做農藥的殘留分析時，已知可能是哪幾種農藥試樣存在，設定好分析條件時，先注入這些推測可能的農藥化合物測出滯留時間，才能與未知試樣比對。若未知試樣的範圍太大，即使滯留時間相同，亦不能確認其成分化合物，需藉由其他儀器做進一步確認。
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8-2 氣相層析儀 定量分析是利用各成分之濃度與圖譜上之尖峰面積成正比的原理。 尖峰面積的求法有切割稱量法、三角測量法和積分器法3 種。
1.切割稱量法 將尖峰之圖形剪下來，然後與已知面積、材質相同的紙張質量相比，即可推算出尖峰面積。
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8-2 氣相層析儀 3.積分器法 利用精密的電子式積分儀器，即可順利求出尖鋒下面積。現在的層析儀都配備有電腦，可以做這樣的運算，因此直接就會顯示出每一個尖峰的面積。 定量分析時，實驗要預先確定待測物，再配製濃度範圍涵蓋試樣濃度之標準液，接著由儀器所得的分析圖譜積分計算波峰面積（或波峰高度），然後由波峰面積（或波峰高度）與濃度繪製之檢量線，便可由檢量線換算求出各成分之濃度，如圖8-27。
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8-2 氣相層析儀 氣相層析儀的實際用途非常廣泛，不管是材料的分析，食品，藥物的品管，毒品、違禁藥品的偵測方面，氣相層析儀都具有重要的實務功能，甚至為了能現場檢測，還開發出現場型氣相層析儀，例如目前常用於石油碳氫化合物分析的現場氣相層析儀，包括可攜式氣相層析儀（portable GC）與可運送氣相層析儀（transportable GC）兩種。可攜式氣相層析儀具有內藏式電池與載流氣體供應系統，耐用、體積小及重量輕，但因受限於電源與氣體的供應，其管柱通常是恆溫（isothermal）。可運送氣相層析儀，操作時需要外部電源與氣體供應系統，故不具有可攜性，通常是安裝於移動式實驗室，大部分的可運送氣相層析儀可以快速改變管柱溫度，故可做適當的溫度設定，精密度因此較高，其用於現場時可以提供等同於實驗室氣相層析儀的分析數據。
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8-3 液相層析儀
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8-3 液相層析儀 液相層析是一種分離的技術，其分離原理會根據管柱的不同而不同，一般分為分配層析、吸附層析、離子交換層析及分子篩層析法，如表8-2，這部分已於8-1 節介紹過。其中主要為分配層析法，此法是利用含混合物之移動相流經固定相，混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同（即親和力不同），因此各成分移動速率不同，而達到分離的目的。試樣化合物與固定相親和力若較強，則沖提較慢（滯留時間長），試樣化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快（滯留時間短）。
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8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀是將固定相之管柱變細、固體顆粒減小，以提高分離效率與減少移動相（沖提液）的使用量，但因為液體通過細微膠體時阻力增大，故需藉由高壓幫浦輸送液體以利移動相流動。目前，高效能液相層析儀為分析實驗必備之研究工具。
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8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀的移動相是液體，儲放於儲液設備。液體中容易溶解空氣，尤其是甲醇與水混合時容易產生氣泡，氣泡中的氮氣或氧氣會對偵檢器造成干擾，因此移動相在使用前，須先除氣，可藉由超音波震盪、加熱、攪拌、濾膜過濾、通氦氣等方式進行，其中通氦氣進入溶劑中，可以趕走其他氣體，且氦氣密度小，會自行排走。最簡單的方式就是用一個非常小孔隙的過濾器在真空下過濾，可以除氣和順便除去懸浮物質。
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8-3 液相層析儀 移動相並不一定為單一純溶劑，可以為混合的溶劑，溶劑分配閥可根據操作者的設定，調整溶劑的混合比例。在移動相的沖提過程中，使用固定比例的溶劑，稱為等位沖提（isocratic elution）；過程中根據時間，設定不同溶劑混合比例者，稱為梯度沖提（gradientelution）。液相層析有時可使用梯度沖提法，以縮短分析時間並增加分離效果，與氣相層析儀的階段升溫類似。
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8-3 液相層析儀 為解決流量脈衝的問題，常使用並聯幫浦或串聯幫浦兩種設計。如圖8-32 為並聯幫浦的設計。當A 幫浦壓縮移動相進入管柱時，B幫浦為退出並吸入移動相，由於A、B兩個幫浦的一進一出方向不同，可以修正流量脈衝，使移動相的液壓維持恆定，以修正流量脈衝的問題；但由於單向閥的數量增多，所以容易造成洩漏，增加了使用和維護的難度。
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8-3 液相層析儀 如圖8-33，為串聯往復式幫浦，A、B兩幫浦的活塞運動速度不一定要相同，一般來說，A 幫浦的活塞運動速度為B 幫浦活塞運動速度的2 倍。因此，相同時間內，A 幫浦提供的流量為B 幫浦的兩倍，B 幫浦提供的移動相溶劑一半直接供給系統，另一半被A 幫浦吸入，稍後供給液相系統，因此可解決流量脈衝的問題。雖然增加脈衝緩衝器，但是減少單向閥使用量，因此可降低儀器所需的維護。
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8-3 液相層析儀 二極體陣列偵檢器，如圖8-42，亦屬於紫外光/可見光吸收原理之偵檢器，其與可變波長偵檢器的差異在於試樣位於光柵之前，因此光柵不需旋轉。二極體陣列偵檢器可得到紫外吸收光圖譜、可做三維圖譜、可最佳化層析檢測條件、可提取所需波長下的層析圖並可進行尖峰純度檢驗等。二極體陣列偵檢器的功能較強，同樣的，操作之參數設置就比較複雜，需要合理設置，以獲得最佳檢測靈敏度。實際運用時，需參考儀器所提供的操作手冊做設定。
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8-3 液相層析儀 圖8-43 為利用二極體陣列偵檢器採集到的紫外吸收光譜進行純度檢驗，純度因數（purity match）為分離之成分試樣與該化合物標準品之光譜圖比較，重疊度越大，純度因數就越高，代表越可能是純物質所流出之吸收峰，純度因數最大值為1000。
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8-3 液相層析儀 高效能液相層析儀可藉由選擇適當管柱（固定相）與適當溶劑的比例（移動相），將混合物試樣分離並純化，因此其應用範圍相當廣泛，包括在化學、化工、生化、農化、醫藥檢驗、環境檢驗、食品飲料等各類試樣分析。尤其對熱不安定、非揮發性物質、高極性成分，不便使用氣相層析儀（GC）者皆可使用HPLC。
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8-3 液相層析儀 選擇沖提劑時，除了考慮極性高低，是否能分離出試樣之外，尚有以下幾點須注意的： 1.沖提液不能改變分離管柱的特性。
2.沖提液適合偵檢器。 3.沖提液要能溶解試樣。 4.沖提液黏度低。 5.沖提液能使分離之試樣成分回收容易。 6.沖提液純度高，通常需使用光譜級溶劑。
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