微生物工程 发酵工程.

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1 微生物工程 发酵工程

2 发 酵 工 程 Fermentation Engineering
新乡学院 生命科学与技术系 主讲教师：张艳芳

3 什么是发酵？

4 第一章 发酵工程概述 发酵工程的概念 发酵工程的发展简史 发酵工程的基本内容 发酵工程常见的发酵类型 发酵工程的后处理

5 第一节 发酵工程的概念 教育部1998年颁布的高等学校本科专业目录把发酵工程划归生物工程类，肯定了发酵工程的生物学属性。 作为生物工程的最接近生产实践的组成部分，发酵工程正在从工业向农、牧、医、药、环保和军事等各生物学相关领域延伸，受到社会的广泛关注。

6 发酵工程 (微生物工程) 定义: 是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。

7 Microbiology engineering
微 生 物 工 程 Microbiology engineering 发 酵 工 程 Fermentation engineering 生化工程 Biochemical engineering

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12 发 酵 工 程 Fermentation Engineering
生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包 生物工程的一个极其重要的分支 微生物学 化学工程 基因工程 细胞工程 机械工程 计算机工程 多学科工程

13 一、发酵的定义 发酵的传统概念 fermentation fervere 酵母作用于果汁或发芽谷物产生二氧化碳的现象
厌氧条件 糖 酵母 酒精 二氧化碳 2. 发酵的现代概念 微生物 有氧或无氧 生命活动 微生物菌体 其它代谢产物

14 二、发酵工程的概念及特点 发酵工程的概念 微生物工业发酵的基本过程 发酵工程技术的特点

15 微生物工业发酵的基本过程 保藏菌种 碳源、氮源、无机盐等营养物质 空气 斜面活化 空气净化处理 扩大培养 种子罐 灭菌 主发酵 产物分离纯化
成品

16 发酵工程 Continuous centrifuges

17 发酵工程技术的特点 发酵工程主体微生物的特点： ①微生物种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强。 容易通过人工诱变获得有益的突变株； ②微生物酶的种类很多，能催化各种生物化学反 应； ③微生物能够利用无机物、有机物等各种营养源； ④可以用简易的设备来生产多种多样的产品； ⑤不受气候、季节等自然条件的限制等优点

18 发酵工程技术的特点： ①发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个 反应过 程能够在发酵设备中一次完成； ②反应通常在常温常压下进行，条件温和，耗能少， 设备较简单； ③原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是 农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有 选择地摄取所需的物质； ④容易生产复杂的高分子化合物，能高度有选择的在 复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入 或去除等反应； ⑤发酵过程需防止污染杂菌

19 发酵工程技术的特点 发酵工程反应过程的特点： ①生化反应，条件温和； ②原料来源广泛； ③多个反应过程在一个反应器内进行； ④产品为小分子物质，容易生产复杂高分子化合物； ⑤反应具有高度的选择性； ⑥生产菌本身也可为产物，发酵液对生物体无害； ⑦注意防止污染杂菌； ⑧进行菌种改良能大幅提高生产水平。

20 Fermentation engineering
上游工程 Upstream Proceesses 发酵工程组成 从广义上讲，由三部分组成： 上游工程、发酵工程、下游工程 下游工程 Downstream Processes Fermentation Process Control

21 Fermentation engineering
上游工程 Upstream Processes * genetics, cell … * inoculum development * media formulation * sterilization * inoculation

22 Fermentation engineering
下游工程 Downstream Processes product extraction, purification & assay waste treatment by product recovery

23 三、发酵工程的产品类型 酿酒 发酵食品 有机酸 醇及有机溶剂 酶制剂 氨基酸 核酸类物质 抗生素 生理活性物质 微生物菌体产品
生物农药及生物增产剂 生物能 环境净化 微生物冶炼 转基因产品 其它

24 发酵工业 发酵食品 有机酸 氨基酸 核酸类物质 酶制剂 医药工业 （抗生素…） 饲料工业（单细胞蛋白 环境工程 （废物处理） 其它 （冶金工业…） Fermentation Industry Fermented Foods Organic Acids Amino Acids Nucleotides Enzymes Pharmaceutical (Antibiotics…) Feedstuff (eg. SCP) Environmental Application (Waste Treatment) Others (eg. Metallurgical industry)

25 第二节 发酵工程的发展简史 传统发酵时期 近代发酵工程时期 近代发酵工程建立初期 近代发酵工程全面发展时期 青霉素发现
第二节 发酵工程的发展简史 传统发酵时期 近代发酵工程时期 近代发酵工程建立初期 近代发酵工程全面发展时期 青霉素发现 人工诱变育种与代谢控制 发酵动力学、发酵的连续自动化工程 微生物酶反应生物合成和化学合成结合 现代发酵工程时期

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28 传统发酵（天然发酵）时期 原始社会就会利用含糖果实进行酒精发酵。 公元前 年,古埃及人熟悉了酒、醋的酿造方法。 我国在 年前的龙山文化时期已有酒器出现。 主要产品有：酒、酱油、泡菜、奶酒、干酪等。 特点：不能控制发酵过程，生产只能凭经验。

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32 近代发酵工程时期----建立初期 纯培养技术的建立（发酵现象的早期认识）
1680年,荷兰的列文虎克(Anthony Leeuwenhoek)制成了显微镜,并通过显微镜观察到了微生物. 19世纪中期，法国的巴斯德（Louis Pasteur)证明了酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。 德国的柯赫（Robert Koch)发明了固体培养基，得到了细菌的纯培养物，由此建立了微生物的纯培养技术。

33 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”
巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。 同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。

34 纯培养技术的建立 发酵工程的早期阶段（厌氧发酵阶段） 19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。 20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）──由食品工业向非食品工业发展 好氧发酵技术：速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。 1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。

35 产品主要有：酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等。
特点：靠厌氧发酵和表面固体发酵。

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38 近代发酵工程时期----全面发展时期 通气搅拌发酵阶段（大规模深层培养阶段） 1928年 Fleming发现青霉素
第二次世界大战中对于抗感染药物的极大需求，促使人们重新研究青霉素。 1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究。表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基 — 40u/ml 至1945年，采用了深层培养技术，将青霉素进行大规模生产。 5m3 — 200u/ml 当今：100m3~200m3 — 5-7万u/ml 链霉素、金霉素、新霉索、红霉素

39 主要的技术进展： 通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。 意义： 抗生素工业的发展建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法推动了整个发酵工业的深入发展为现代发酵工程奠定了基础 主要产品： 各种抗生素、氨基酸、酶制剂、维生素等。 特点：发酵产量大大提高，可选择性地发酵所需产物

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41 现代发酵工程时期 利用现代分子生物技术即DNA重组技术所获得的“工程菌”、细胞融合所得的“杂交”细胞以及动植物细胞或固定化活细胞等，是发酵工业的范畴突破了利用天然微生物的传统发酵，逐步建立起新型的发酵体系，生产天然微生物或人体及其它动植物所不能产生或产量很少的特殊产物。 主要技术： 现代分子生物技术—DNA重组技术（基因工程技术） 高密度培养技术 主要产品： 蛋白质、多肽药物

42 发酵工程的发展 从少量培养到到大量培养 从浅层培养到厚层或深层培养 从固体培养到液体培养 从静止式液体培养到通气搅拌式液体培养
从单批培养到连续培养以致多级连续培养 从利用分散的微生物细胞到利用固定化的细胞集团 从单纯利用微生物细胞到大量培养利用动植物细胞 从单菌发酵到混菌发酵 从利用野生菌株发酵到利用变异菌株以及工程菌发酵

43 发酵工艺过程 菌种以及确定的种子培养基和发酵培养基的组成 培养基、发酵罐和辅助设备的灭菌 大规模的有活性、纯种的种子培养物的生产
发酵罐中微生物最优的生长条件下产物的大规模生产 产物的提取、纯化 发酵废液的处理

44 发酵工程关键技术 菌种选育技术 纯种培养技术 发酵过程优化技术 发酵过程放大技术 发酵工程下游分离纯化技术 发酵过程自动监测、控制技术
自然选育 抗噬菌体选育 诱变选育 代谢工程育种 基因定向育种 基因组改组 细胞生长过程研究 微生物反应的化学计量 生物反应动力学 生物反应器工程 发酵罐几何相似放大 供氧能力放大 菌体代谢相似放大 培养条件相似放大 数学模型模拟与预测放大

45 第三节 发酵工程的基本内容 一、发酵工程的一般特征 1. 发酵工程的一般特征 2. 存在问题 副产物多，产品提取精制困难
第三节 发酵工程的基本内容 一、发酵工程的一般特征 1. 发酵工程的一般特征 2. 存在问题 副产物多，产品提取精制困难 微生物本身的稳定性受多种因素影响 原料价格问题 生产前的准备工作量大 反应器效率问题 发酵废液的污染问题（BOD、COD）

46 二、发酵工程菌种的特点 ①能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，产量高； ②培养条件易于控制；
③生长迅速。发酵周期短； ④满足代谢控制的要求； ⑤抗噬菌体和杂菌的能力强； ⑥遗传性状稳定，菌种不易变异退化； ⑦不是病原菌，不产生有毒有害生物活性物质。

47 三、发酵工程中常见发酵罐的类型 发酵罐的定义 （一） 工业常用发酵设备发展简史 第一阶段：1900年以前 第二阶段：1900~1940年
第三阶段：1940~1960年 第四阶段：1960~1979年 第五阶段：1979年至今 发酵设备特点: 纯培养、严密性、高度可靠性 发酵设备发展趋势：大型化、自动化

48 （二）发酵罐的类型和特征 发酵罐的分类 ①按微生物生长代谢需要分类 好氧:抗生素、酶制剂、氨基酸、酵母、维生素 厌氧：乙醇、丙酮、丁醇、啤酒、乳酸 ②按容积分类 实验室发酵罐： ~50L 中试发酵罐: ~5000L 生产规模发酵罐: >5000L

49 ③按照发酵设备特点分类

50 （二）发酵罐的类型和特征 ④按微生物生长环境分类 悬浮生长系统 支持生长系统 ⑤按操作方式分类 分批发酵 连续发酵 ⑥其它类型 新技术的采用

51 （二）发酵罐的类型和特征 发酵罐的基本特征 ①适宜的高径比 ②能承受一定的压力 ③搅拌装置能够使气液充分混合 ④减少死角，灭菌彻底，防止染菌 ⑤足够的冷却面积 ⑥轴封严密，减少泄露

52 （二）发酵罐的类型和特征 3. 发酵罐的设计原则 为菌体生长或为某一特定微生物混合发酵剂提供 一个便于控制的环境，获得期望的产物。 ①保证无菌，稳定运转 ⑦内表面光滑 ②满足代谢需要，不损伤菌体 ⑧适应性好 ③功率消耗低 ⑨能够适应放大生产 ④有检测系统及采样装置 ⑩配套完善，造价低 ⑤蒸发损失小 ⑥操作过程劳动力消耗小

53 2 3 （三）常见的工业发酵罐类型 机械搅拌通气发酵罐 (1) 机械搅拌通气发酵罐

54 搅拌器：作用是打碎气泡，使氧溶解于发酵液中，从搅拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消耗也最大，弯叶次之，箭叶最小。为了拆装方便，大型搅拌器可做成两半型，用螺栓联成整体。

55 (2) 自吸式发酵罐

56 自吸式发酵罐： 不需空气压缩机提供加压空气，而依靠特设的机械吸气装置或液体喷射吸气装置吸入无菌空气，实现混合搅拌与溶氧传质的发酵罐。
应用： 酵母及单细胞蛋白生产、醋酸发酵 、维生素等生产

57 优点： (1)不必配备空气压缩机及其附属设备，节约设 备投资，减少厂房面积； (2)溶氧速率高，溶氧效率高，能耗较低； (3)生产效率高、经济效率高 (4)设备便于自动化、连续化。 缺点： 较易产生杂菌污染，需配备低阻力损失低高效空气过滤系统，罐压较低，装料系数约为40％。

58 （三）常见的工业发酵罐类型 2. 气升式环流发酵罐 把无菌空气通过喷嘴或喷孔喷射进入发酵液中，通过气液混合物的湍流作用而使空气泡分割细碎，同时由于形成的气液混合物密度降低故向上运动，而气含率小的发酵液则下沉，形成循环流动，实现混合与溶氧传质。

59 特点： 1）反应溶液分布均匀 2）较高的溶氧速率和溶氧效率 3）剪切力小 4）传热良好 5）结构简单 6）能耗小 7）不易染菌 8）操作和维修方便

60 （三）常见的工业发酵罐类型 3. 塔式发酵罐

61 四、发酵过程的优化 过程优化的定义 最佳过程控制方案；过程中主要控制项目和方法 2. 过程优化的目的 简化、优化、适于发酵进行，满足生产要求
2. 过程优化的目的 简化、优化、适于发酵进行，满足生产要求 过程优化的研究内容 （1）微生物细胞生长过程 （2）微生物反应的化学计量 （3）生物反应动力学 （4）生物反应器工程

62 发酵优化的研究思想：发酵是一个过程 初始条件 过程分析 过程强化 条件确定 过程优化

63 研究方法 在理论和技术上有突破，在工业生产中能广泛应用 显著提高发酵过程的经济性和科学性 基于细胞表观特性进行优化 基于细胞内部分析进行优化
4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L) A 20 40 60 80 100 120 140 r (Glucose) / (g/L) B 10 30 50 70 (Pyruvate) / (g/L) C 优化策略 高产量 高底物转化率 高生产强度 在理论和技术上有突破，在工业生产中能广泛应用 显著提高发酵过程的经济性和科学性

64 1 基于微生物反应原理的培养环境优化技术 基本思想 发酵优化技术 基于底物运输、生化反应、产物排出
确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响 优化微生物生长的物理和化学环境 保证微生物生长处于最适条件 Prod. Distribution 奠定基础

65 内容 ●培养基组成的优化技术 ●发酵环境条件的优化技术 目的 ●确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足
●减少副产物的形成，使底物转化率明显提高 ●对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产量明显提高 ●分析不同环境条件下微生物的生理学

66 2 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术 发酵优化技术 研究思想 发酵过程的动力学参数(μ，qp，qs) 不同T、pH、RPM、DO 分析
流变学参数的变化特性 分阶段控制策略 提出 分阶段T、pH、RPM、DO 控制环境条件在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平 目的

67 3 基于反应动力学和人工智能的优化和 控制技术 发酵优化技术 研究思想 以数学模型为基础的优化 建立动力学模型，求解参数并评价其适用性
Model Form Monod Constant yield u = umax s/(K m + s) Y x/s = Y0 Substrate inhibition u = umax s/(Km + s + s2/Ki) Variable yield u = umax s (1 -– T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 -– T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition Inhibitions Constants yields u = umax o (1 -– P/P m ) q p = alpha. u+ beta alpha, beta and Y p/s 建立动力学模型，求解参数并评价其适用性 优化发酵过程 对发酵进程和产量指标进行预测

68 以生理模型为基础的优化 采用人工神经网络、专家系统、模糊逻辑控制技术 对发酵过程进行在线状态预测和模式识别 自适应最优化控制系统的开发、计算机模拟和实际应用

69 4 基于代谢通量分析的过程优化技术 发酵优化技术 研究思想 参考已知的生化反应计量关系、代谢途径、生理、特征，构建、合成不同产物的代谢网络。
利用代谢通量分析方法，计算得出胞内各条代谢途径的通量变化。

70 目的 分析不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出一系列发酵优化策略。

71 5 基于环境胁迫条件下微生物生理应答的 过程优化技术 发酵优化技术 环境压力或胁迫
饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等 ADP NAD+ 长期胁迫－可遗传性的应答（遗传变异） 短期胁迫－不可遗传性的应答（生理性的) ATP NADH Pyruvate Aerobic Anaerobic Mitochondrion ethanol ATP 细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的激活以及代谢途径的临时调整等

72 学术思想 研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成目的产物。

73 6 基于微生物代谢的辅因子调控的过程 优化技术 发酵优化技术 学术思想
研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物合成目的产物的代谢流的最大化和快速化。 Cofactors Metal ions NADH/NAD+ NADPH/NADP+ ATP/ADP/AMP CoA/Acetyl-CoA Vitamins

74 发酵过程优化与控制技术研究举例

75 X 举例1：丙酮酸发酵 如何得到丙酮酸高产量发酵？--菌株选育和培养条件优化 光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径
Glucose Glucose Pyruvate 光滑球拟酵母中丙酮酸代谢途径 PDH (B1, NA) PDC (B1) PT (B6) PC (Bio) X Alanine Pyruvate Acetaldehyde Ethanol Pyruvate AcCoA B1： 硫胺素 NA： 烟酸 Bio：生物素 B6： 吡哆醛 OAA OAA Citrate -KG 选育自身不能合成维生素的酵母(维生素缺陷型) 控制培养基中维生素浓度

76 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？--分阶段溶氧控制
代谢网络分析 DO=10% DO=85% PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸进一步代谢的通量下降了63.3% 高溶氧下转化率高的原因 动力学分析 t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E q s / h - 0.1 0.2 0.3 10 20 30 40 50 60 F p 0.6 m D 高溶氧下，丙酮酸转化率较高，但生产强度(葡萄糖消耗速度)较低 低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙酮酸产率却明显下降 辅因子分析 总ATP下降31.4%, NADH下降18.6% 生产强度 (葡萄糖消耗速度) 59％ 低溶氧生产强度高的原因 DO=10% DO=85%

77 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?--分阶段溶氧控制
采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！ 分阶段溶氧控制！如何分阶段？ 碳平衡分析 前16 h较高溶氧有利于碳流合成细胞； 16 h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸 结果 确定分阶段供氧模式:发酵0-16 h控制kLa为450 h-1，16 h后将kLa降低至200 h-1 高产量(89.4 g/L) 高产率(0.636 g/g) 高生产强度(1.95 g/(Lh))

78 举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控
国家863重点项目和国家支撑项目 L-山梨糖 2-酮基-L-古龙酸 南开大学功能基因组学中心、国内最大Vc生产企业 小菌(氧化葡萄糖杆菌G. oxydans ) 大菌(巨大芽孢杆菌B. megaterium ) + 实现组学技术解决发酵工业长期问题的典型 现况：维生素C两步发酵工艺 小菌单独培养生长、产酸困难 大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸

79 小菌测序 代谢途径分析 从代谢途径角度解析两菌关系 大菌测序 代谢途径分析 基因组测序步骤 鸟枪法测序 提取基因组DNA 基因文库构建
大规模测序 序列拼接 填补缺口 打断基因组DNA 衔接子连接 单链DNA与磁珠结合 油滴中PCR反应 测序反应 基因组注释 罗氏GSFLX高通量基因组测序 代谢途径分析

80 G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和D途径的全部酶基因 缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全
氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析 G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和D途径的全部酶基因 缺失编码磷酸果糖激酶的基因，糖酵解途径不完全 无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通过糖异生生产C6 缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全

81 蛋白质组学 小菌单独发酵时胞内蛋白表达 功能蛋白确定，研究大菌影响小菌产酸的机制 大菌存在时小菌胞内蛋白表达 K. Vulgar
B. megaterium

82 举例2：维生素C发酵微生物的功能优化与调控
目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能 发酵优化 明确大菌调控小菌的作用方式 阐释大小菌之间的功能关系 发展调控小菌生理功能的策略 提高糖酸转化率 提高VC产量 提高生产强度 基因测序 目标2：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新 葡萄糖 功能蛋白 大菌特定的代谢途径 3-磷酸甘油醛 丙酮酸 TCA循环 L-山梨酮 2-酮基-L-古龙酸 L-山梨糖 2-酮基-L-古龙酸生产途径 产物解析 Vc

83 举例3：透明质酸(HA)发酵过程优化与控制
食品添加剂 化妆美容 关节炎治疗 透明质酸三级结构 优良理化性质：粘弹性 高保湿性 生物相容性 高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈 HA发酵存在问题 乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用 细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争

84 高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈
问题 高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈 透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究 表观黏度 搅拌转速 表观粘度 剪切力对菌体形态影响 溶氧水平 溶氧水平 有效搅拌区域模型 溶氧传递系数 有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学(Va=1） 理想HA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧

85 高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈
问题 高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈 降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率 氧化还原降解HA提高混合与传质效率 添加H2O2,Vc 添加H2O2/抗坏血酸对流体力学影响 过氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解HA 氧化还原降解HA没有破坏其基本结构单元 HA氧化还原降解对HA发酵的影响 FT-IR分析结果

86 小 结 对微生物发酵过程进行解析（生理、动力学、代谢网络） 根据不同发酵过程的特点，提出相应的优化控制策略
小 结 对微生物发酵过程进行解析（生理、动力学、代谢网络） 根据不同发酵过程的特点，提出相应的优化控制策略 实现微生物发酵过程高产量、高产率和高生产强度的有机统一

87 五、发酵工业的逐级放大 什么是发酵工业的逐级放大？ 小试、中试、大试 2. 怎么进行逐级放大？

88 第四节 发酵工程常见的主要发酵类型

89 一、液体发酵与固体发酵 （一）液体发酵（液体培养） 定义 特点：控制溶氧速率 方法：增加液体与氧的接触面、 提高氧分压 措施：浅层液体发酵
三角瓶振荡培养（shaking flask culture） 深层培养（submerged culture） 机械搅拌 提高罐压

90 （一）液体发酵（液体培养） 实验室常见液体发酵方式 试管液体培养 浅层液体培养 药瓶培养 台式发酵罐

91 （一）液体发酵（液体培养） 2. 工业生产中常见液体发酵形式 浅盘培养（shallow pan culture) ） 发酵罐深层培养 注意：目前能够大规模液体培养的厌氧菌仅限于丙 酮-丁醇发酵一种。

92 一、液体发酵与固体发酵 （二）固体发酵（固体培养、固态发酵） 定义 特点：开放、非纯培养、无菌要求不高 方法：薄层、厚层发酵 过程

93 （二）固体发酵（固体培养、固态发酵） 实验室常见的固体培养 试管斜面、培养皿平板、克氏扁瓶和茄子瓶斜面等 2. 工业生产中常见的固体培养 曲盘培养 转鼓培养 通风曲槽培养 注意： 固体培养基含水量40%~80%； 液体培养基含水量95%以上。

94 二、厌氧发酵与好氧发酵 厌氧发酵（静止培养） 酒精发酵、沼气发酵 排除氧气、密封、大剂量接种（10~20%） 好氧发酵（有氧发酵）
供氧（通气、通气搅拌、表层培养） 多数发酵属有氧发酵。

95 三、分批发酵与连续发酵 （一）分批发酵 分批发酵（分批培养） 在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发酵）和为调
节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料 交换的一种发酵方式。 培养基一次性加入，产品一次性收获， 目前广泛采用的一种发酵方式。 一次进料，一次放料。 非稳态过程。

96 三、分批发酵与连续发酵 分批发酵 优点： ① 工艺操作简单； ② 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题； ③ 产物浓度比连续发酵要高。
缺点： ① 人力、物力、动力消耗较大； ② 生产周期较长,生产效率低 最常见的操作方式

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98 三、分批发酵与连续发酵 （一）分批发酵 补料分批发酵 指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培
养基或某些营养物质，但并不连续地向外放出发酵液 的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种 发酵技术,即半连续发酵，或半连续培养。

99 三、分批发酵与连续发酵 （一）分批发酵 补料分批发酵 类型： 连续补料、不连续补料 快速补料、恒速补料、指数速度补料、变速补料
变体积补料、恒体积补料 单组分补料、多组分补料 重复补料分批发酵

100 三、分批发酵与连续发酵 （一）分批发酵 补料分批发酵 优点： ① 可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物 阻遏作用。
① 可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物 阻遏作用。 ② 避免一次投料营养造成丰富，菌体大量生产带来的溶氧问题。 ③ 可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率； ④ 菌种的变异及杂菌污染问题易控制； ⑤ 便于自动化控制

101 三、分批发酵与连续发酵 （二）连续发酵 指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。 连续发酵可分为单罐连续发酵和多罐串联连续发酵等方式。 连续发酵又可分为菌体再循环发酵和菌体不循环发酵等方式。

102 三、分批发酵与连续发酵 （二）连续发酵 优点： ① 设备的体积减小； ② 操作时间短，操作管理方便，便于自动化控制；
③ 产物稳定，人力物力节省，生产费用低。 缺点： ① 对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高； ② 与分批发酵比，营养成分利用较差，产物浓度低； ③ 杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。

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105 四、单一纯种发酵与混合发酵 （一）单一纯种发酵 无菌操作、纯培养技术 （二）混合发酵 多种微生物混合在一起共用一种培养基进行发酵，混合培养。
限定混合培养物发酵 混合发酵的特点： ⑴充分利用培养基、设备、人员和时间，实现三少一多 ⑵混合发酵能够获得一些独特的产品。 ⑶通过不同代谢能力的组合，完成复杂的代谢作用。

106 五、固定化发酵技术 固定化酶反应器 固定化细胞发酵反应器

107 第五节 发酵工程的后处理 从发酵液中提取、分离、精制有关发酵产品的过程 称为生物工业技术的下游技术。 发酵工程产品纯度要求高、
第五节 发酵工程的后处理 从发酵液中提取、分离、精制有关发酵产品的过程 称为生物工业技术的下游技术。 发酵工程产品纯度要求高、 其分离精制的投入占整个工厂投资的60%左右。 微生物发酵液 动植物细胞组织培养液 酶反应液 下游研究费用占整个费用的50%以上；产品的成本构成中分离纯化的成本站全部成本的40-80%; 大多数酶70%。

108 第五节 发酵工程的后处理 一、发酵工程后处理技术的特点
第五节 发酵工程的后处理 一、发酵工程后处理技术的特点 ⒈目的产物在发酵液中的含量低，产品价格与产物浓度呈反比。 如青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（<50ug/ml）。 ⒉发酵液成分复杂，复杂的多相体系。 ⒊目标成分的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。 ⒋要求产品的纯度很高。 ⒌发酵液均一性的相对性 。分批操作中，生物变异性大，各批发酵液不尽相同，分离有一定的弹性 原料体系复杂 产品种类繁多 含量低 易变性 具经验性

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110 第五节 发酵工程的后处理 二、发酵液的特点 ⑴发酵液大部分是水，90~99%。 ⑵发酵液黏度大，悬浮固形物主要为菌体和蛋白质胶状物。
第五节 发酵工程的后处理 二、发酵液的特点 ⑴发酵液大部分是水，90~99%。 ⑵发酵液黏度大，悬浮固形物主要为菌体和蛋白质胶状物。 ⑶发酵液培养基残留，成分复杂。 ⑷发酵液中除产物外，还含有其它代谢副产物。 ⑸发酵液中还含有色素、热原质、毒性物质等有机杂质。

111 第五节 发酵工程的后处理 三、下游工程目的产物的特点 ⑴生理活性物质，不稳定，易变性，易失活。 ⑵相对分子质量较大。 ⑶浓度低。
第五节 发酵工程的后处理 三、下游工程目的产物的特点 ⑴生理活性物质，不稳定，易变性，易失活。 ⑵相对分子质量较大。 ⑶浓度低。 ⑷生物制剂含有丰富的物质，易被微生物污染和分解。 ⑸成分较为复杂。 ⑹功能因子参与人体机能精细调节，质量要求高。

112 第五节 发酵工程的后处理 四、发酵产物提取精制的基本流程 预处理 初步分离 高度纯化 成品制作 原料中产品浓度越低， 下游提取成本越高。
第五节 发酵工程的后处理 四、发酵产物提取精制的基本流程 预处理 初步分离 高度纯化 成品制作 原料中产品浓度越低， 下游提取成本越高。 下游工艺步骤越多， 提取收率越低。 减少下游工艺过程 多种提取技术集成 下游技术与育种、工艺结合，形成系统工程

113 离心、过滤 萃取、蒸馏、盐析、离子交换与吸附、超滤、蒸发、反渗透 破碎：化学法、酶法、物理法 提取：水或有机溶剂萃取 层析、结晶、蒸馏、电泳 结晶、喷雾干燥、冻干、无菌过滤

114 第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （一）发酵液的预处理、固液分离与细胞破碎 预处理的目的 预处理的要求 预处理的方法
第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （一）发酵液的预处理、固液分离与细胞破碎 预处理的目的 预处理的要求 预处理的方法 胞内产物：多收集菌体 胞外产物：改善过滤特性 提高产物液相浓度 去除部分杂质 菌体分离 固体悬浮物的去除 杂蛋白的去除 重金属离子的去除 色素、有毒物质等杂质的去除 降低黏度：加水稀释、加热 调整pH 凝聚与絮凝 加入助滤剂 加入反应剂

115 凝聚与絮凝 1）加入凝聚剂 凝聚作用是指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。

116 在发酵液中加入具有相反电性的电解质： ①、中和胶粒电性，降低双电层排斥力。 ②、离子的水化作用，破坏胶粒的水化层。 影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+ 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。

117 2）加入絮凝剂 絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物，如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等。 絮凝剂具有长链线状的结构，易溶于水，其分子量可高达数万至一千万以上，在长的链上含有相当多的活性功能团。 3）混凝 非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，具有凝聚和絮凝双重机制，可提高过滤效果。

118 影响絮凝效果的因素主要有： （1）絮凝剂的分子量： （2）絮凝剂的用量： （3）溶液pH值： （4）搅拌速度和时间：

119 加入助滤剂 一种不可压缩的多孔微粒，使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，提高过滤速率。 常用的 助滤剂：硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、 碳粒等 使用方法： 在过滤介质表面预涂助滤剂(1～2mm)，过滤速度低，滤液透明 直接在发酵液中加入过滤介质

120 第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （一）发酵液的预处理、固液分离与细胞破碎 过滤 离心 气浮 过滤操作：滤饼过滤
第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （一）发酵液的预处理、固液分离与细胞破碎 过滤 过滤操作：滤饼过滤 澄清过滤 料液流动方向： 封头过滤 错流过滤 推动力：重力过滤 加压过滤 真空过滤 离心过滤 离心 气浮

121 第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （二）初步纯化（提取） 1. 吸附法 2. 离子交换法 3. 沉淀法 4. 萃取法
第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （二）初步纯化（提取） 1. 吸附法 2. 离子交换法 3. 沉淀法 4. 萃取法 5. 膜过滤法

122 沉淀类型 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 成盐沉淀法 其它沉淀法

123 盐析沉淀机理： 减弱静电斥力 去水化膜 盐析的机制： 高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐
离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定 的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层； 另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水 的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集 而沉淀。 盐析沉淀机理： 减弱静电斥力 去水化膜

124 分级盐析法

125 胰岛素纯化： 胰岛素 pH8 除去碱性杂蛋白 pH3 除去酸性杂蛋白

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127 吸附 盐析 猪心提取液 洗脱液 上清液 上 清 细胞色素C 沉淀（去除） 人造沸石 45%饱和硫酸铵 沉淀 透析 TCA

128 萃取方法 溶剂萃取法 两水相萃取法 超临界液体萃取法 逆胶束萃取法

129 超临界流体（supercritical fluid ，简称SCF）萃取
技术，又称压力流体萃取、超临界气体萃取、临 界溶剂萃取等，是利用处于临界压力和临界温度 以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能 力来进行分离纯化的技术。 当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc) 以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许 多特殊的物理化学性质： 流体的密度接近于液体的密度,粘度和扩散系数接近于气体； 在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感； CO2为最常用的超临界萃取剂。

130 双水相萃取法（Aqueous Two-phase Extraction）
又称水溶液两相分配技术，它利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，称为双水相萃取法。 特点： 能保留产物的活性，操作可连续化，可纯化蛋白质2~5倍。

131 如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合，静置平衡后，分成互不相溶的两个水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖
PEG/DEX形成的双水相的组成

132 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
作用力为斥力：形成双水相体系 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相为水相 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相

133 双水相体系的种类 两种都是非离子型高聚物 （PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等） 其中一种是离子型高聚物 （羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX） 两种都是离子型高聚物 （羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠） 其中一种是无机盐 （磷酸盐、硫酸盐等）

134 双水相萃取工艺流程

135 反胶束萃取 反胶束（reversed micelle），也称反胶团或反微团，是表面活性剂分散在连续的有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。

136 表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临
界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极 性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性 核，此极性核具有溶解极性物质的能力。 当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接 触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内 部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋 白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。

137

138 第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （三）高度纯化（精制） 色谱分离 结晶

139 色谱法是一种分离(分析)方法 它利用物质在两相中分配系数的微小差异，通过两相的相对移动，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，从而使各组分得到分离，并应用物理或化学方法进行检测，应用信息技术进行信号采集和数据处理分析，以达到定量或定性或分离制备的目的。

140 色谱法的发展历史 年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用 1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。 1931
Kuhn, Lederer 用氧化铝和碳酸钙分离α-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。 1938 Izmailov, Shraiber 最先使用薄层色谱法。 Taylor, Uray 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941 Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。 1944 Consden等 发明了纸色谱。 1949 Macllean 在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 1952 Martin, James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956 Van Deemter等 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958 Golay 发明毛细管柱气相色谱。 1959 Porath, Flodin 发表凝胶过滤色谱的报告。 1964 Moore 发明凝胶渗透色谱。 1965 Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。 1981 Jorgenson等 创立了毛细管电泳法。

141 按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）． 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC,早期液相色谱的一种类型,现较少使用）。随着色谱技术的发展，通过化学反应将固定液物质键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱称化学键合相色谱（CBPC,已广泛取代LLC）。 超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。

142 按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同 而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度(或分配系数) 不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小 不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而 达到分离的方法，称为凝胶色谱法或体积排阻色谱法。 利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲 和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分 离。

143 色谱法的分类

144 　　　色谱效率 差速移行过程 淋洗液 影响因素： 流动相的组成；固定相的组成；分离体系的温度

145 色谱流出曲线（色谱图） h (时间) 保留值； 标准偏差

146 　　　 基本保留原理 容量因子（保留因子）： 保留方程式： 选择因子（相对保留值）： 柱效： 分辨率：

147 R < 1.0 两峰明显重叠 R = 1.0 两峰达97.7%分离 R  1.5 两峰完全分开

148 柱 效 样品负载量 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个 精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相
　　　 柱 效 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个 精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相 间的分配行为，同时引入理论塔板数(及理论塔板高度) 作为衡量柱效率的指标。 　 　　样品负载量 柱容量；是指色谱柱对一中溶质可容纳的最大量值。

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150

151 吸附剂及被吸附物极性对吸附的影响 极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附 非极性物质； 极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质；
非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。

152 辅酶A制备

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156 混合床：将阳、阴两种树脂混合而成，脱盐效果好。
(a)为水制备时的情形； (b)为制备结束，用水逆流冲洗。阳、阴树脂根据比重不同分层，阳 树脂较重在下面，阴树脂在上面； (c)为上部、下部同时通入碱、酸再生，废液自中间排出； (d)为再生结束，通入空气，将阳、阴树脂混合、准备制水

157 结晶的概念： 溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排 列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对 称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上 呈规则的排列 固体有结晶和无定形两种状态 结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列， 粒子排列有规则 无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则

158 几种典型的晶体结构

159 只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。
通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中， 再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。 结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。

160 第五节 发酵工程的后处理 五、发酵产物提取的基本方法 （四）成品加工和发酵废液排放

161 3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现。
1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。 2)、分离步骤尽可能少。 A)、 φn 总回收率，λn 各单元回收率。 分离步骤越多，回收率越低；如φ10 = = 0.63，φ5 = =0.77 B)、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。 3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现。 比如，分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。

162 4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 A)、引起新的化学污染； B)、蛋白质的变性失活  5)、合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。

163 发酵工业的意义与展望 利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种 采用发酵技术进行高等动动植物细胞培养 固定化技术广泛应用
开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段 应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸 将生物技术理论广泛地用于环境工程

164 离心方法 （一）差速离心法 概念：差速离心法亦称为“差分离心法”，是依据不同 大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不
同进行离心分离的一项技术。 过程：将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使 颗粒大的组分沉降于管底，上层液再用加大的 离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的 组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需 组分，故称其为差分离心法。

165 特点：差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个
数量级内的各种粒子不容易分开。 用途：常用于颗粒或密度差别较大的组分的分离， 或其他分离手段之前的粗制品提取。

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168 （二）密度梯度离心法 概念： 又称速度区带离心法或分级区带离心法。离心操 作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密 度梯度液上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），控制 离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的 密度梯度层内，分成一系列区带，从而达到彼此分 离的目的。

169 特点： （1）样品加于特定部位、离心时间须严格控制。 （2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值≤组分最 小密度。 （3）分离依据是各组分之沉降系数差。 （4）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系 数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。 用途： 适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分 ，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒 体、溶酶体及过氧化物酶体等。

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171 （三）等密度离心法 概念： 离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯 度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其 密度与介质密度相等的位置便不再移动，形 成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密 度不同处于区带的不同位置。

172 特点： （1）加样位置不拘。 （2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间 　　　影响。 （3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密 度。 （4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大 　　　小，形状无关。 （5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度 梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。