共聚焦激光扫描（荧光）显微镜.

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1 共聚焦激光扫描（荧光）显微镜

2 　激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。

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4 共聚焦激光扫描显微镜 共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope ,CLSM) 是1987年面世并发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称。成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具。

5 共聚焦显微镜的优点 减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节

6 Wide-field microscopy

7 Fluorescent Microscope
Arc Lamp Fluorescent Microscope Excitation Diaphragm Excitation Filter Ocular Objective Emission Filter

8 Confocal microscopy

9 Confocal Principle Laser Excitation Pinhole Excitation Filter PMT
Objective Emission Filter Emission Pinhole

10 Arc Lamp Laser Excitation Diaphragm Excitation Pinhole
Fluorescent Microscope Confocal Microscope Arc Lamp Laser Excitation Diaphragm Excitation Pinhole Excitation Filter Excitation Filter Ocular PMT Objective Objective Emission Filter Emission Filter Emission Pinhole

11 原理示意图 光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦），使得来自焦平面以外的光远离检测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点地、一行一行地扫描样品，将象素资料合成一个图象。通过移动焦平面，单个图象（光限幅）可以放在一起，形成可以以后进行数字处理的三维栈。

12 How a Confocal Image is Formed
Condenser Lens Pinhole 1 Pinhole 2 Objective Specimen Detector Modified from: Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B.Pawley, Plennum Press, 1989

13 基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术 探测器 小孔 聚焦透镜 激光束 分光器 光学扫描 Quarter Wave Plate 物镜 窗口
组织样品

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15 色素痣 A 明亮的黑素细胞巢围绕真皮乳头呈圆形或椭圆形分布，细胞形态规则，大小及明亮度均一。细胞间有间隔。 B

16 皮肤影像学 对皮肤疾病的治疗与疗效评估需要先进的皮肤诊断技术 无创、原位、动态、即时 对可疑皮损部位可进行多次、重复观察
提供客观、量化的评估指标 皮肤影像学

17 内窥式激光共聚焦显微镜 横向分辨率为3.1um；轴向分辨率为16.6um
J。Knitrtel et. al. optics communications 188(2001)

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19 In vivo fiber-optic confocal reflectance
microscope with an injection-molded plastic miniature objective lens

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21 Fibered Confocal Fluorescence Microscopy

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23 光学低相干层析成像（OCT）

24 背景 生物医学光子学是光学与生命科学相互交叉、相互渗透的一个边缘学科，是关于光辐射与生物组织之间相互作用的学问。
光学技术在生物医学中应用由来已久，早在17世纪，光学显微镜的发明将医学研究提高到细胞形态学水平。

25 二十世纪七十年代之后，激光技术已成为临床治疗的有效手段：激光诊断(以激光作为信息载体) 激光纤维内窥镜； 激光扫描共焦显微镜； 激光多普勒血流计； 激光光谱诊断技术；
激光治疗(以激光作为能量载体) 光动力疗法治癌； 激光外科手术； 准分子激光角膜成形术；等

26 简介 进入二十世纪九十年代，由于医学对无辐射损伤、高分辨率层析成像的需求，光学相干层析成像技术（OCT，Optical Coherence Tomography）孕育而生，并逐渐成为该领域的研究热点。 OCT是继超声、X射线、核磁共振等层析成像技术之后，又一种新型的层析成像技术。 OCT将激光技术、超灵敏光电探测、精密自动控制和计算机图像处理等多项技术综合为一体。 光学相干层析成像（Optical Coherence Tomography, OCT）作为一种全新的光学层析成像技术，以其无辐射、非侵入、高分辨率及高探测灵敏度等特点，在临床医学领域具有巨大的发展前景。

27 发展历史 光学低相干反射测量技术（OLCR） OLCR最早形成于七十年代，它利用低相干光干涉原理测量反射光的幅度和相对相位，从而获取传输介质的内部信息。 用途：集成光纤器件的特征或瑕疵检测。 1991年，美国的麻省理工学院的J. G. Fujimoto和D. Huang等人成功地开发了光学相干层析成像技术，该技术结合了共焦显微术和低相干光的外差探测技术，通过快速扫描实现二维或三维层析成像。 OCT 是由早期一维光学相干域反射测量技术( OCDR)发展而来的，1991年，麻省理工学院J. G. Fujimoto等人成功地开发了光学相干层析成像技术，该技术结合了共焦显微术和低相干光的外差探测技术，通过快速扫描实现二维或三维层析成像。

28 光学相干层析成像技术的优点 1)无辐射损伤、非侵入性 与X射线、核磁共振（MRI）等有损层析成像技术相比，OCT具有无比的优越性。
2)高灵敏度 由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测。典型的OCT系统可达到90dB~100dB的探测灵敏度，能够探测来自高散射生物组织2~3mm深度的光学信号，例如：浅表皮肤。 3)高分辨率 OCT图像的轴向分辨率和横向分辨率互不相关，它能提供独立于横向分辨率的近似于微米量级（1～10μm）的轴向分辨率。 4)结构简单、成本低廉 OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成像原理简单，制造成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在市场中购买。

29 OCT在医学诊断领域的主要应用 OCT技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管疾病、内腔肠胃道疾病、皮肤癌的早期诊断以及胚胎发育生物学等研究中，都具有重要的应用价值： 眼科检查 皮肤烧伤检查 内腔活检

30 眼科检查： 利用OCT技术，可用于眼底视网膜在微观解剖结构上病变的检测，也可用于眼前部角膜、虹膜、晶状体等组织的检测或参数测量。它是青光眼、糖尿病水肿等视网膜疾病早期诊断的有效工具。
Ultra broad spectra enable micrometer resolution SLD 20nm FWHM FEMTOSOURCE 100 nm FWHM

31 皮肤烧伤检查： 烧伤组织与正常组织的具有不同的光学各向异性特征，采用偏振敏感的OCT成像，可以检测组织表层的烧伤程度。

32 内腔活检： OCT结合内窥镜，可以将检测范围拓宽到体腔内部的呼吸道、消化道、泌尿系统以及心血管系统等，实施活体无损的高分辨率截面成像。
心脏血管

33 OCT还可以在制药、工业测量等领域中得到应用。
感光性树脂

34 时域OCT的成像原理 以迈克尔逊干涉仪为核心，利用光源的低相干特性，当参考臂和样品臂的光程匹配时（光程差在一个相干长度范围内），才能产生干涉条纹 通过测量背向散射光来反映组织内部折射率的非连续性变化，干涉条纹的幅度与背向散射光的强度成正比 深度分辨率 = 光源的相干长度 横向分辨率 = 聚焦光斑的大小 (1 – 10 microns) 探测深度: 对于高散射生物组织可以达到 1 – 3 mm

35 OCT的空间分辨率

36 时域光纤OCT 光纤OCT的特点: 灵活性 可携带 易于集成到其他医学成像仪器，例如：内窥镜

37 关键技术要点 可选择的宽带光源: (中心波长，谱宽，功率，稳定性，易用性) 1.连续光源: SLD/LED 2.脉冲光源: 钛锁模飞秒激光器
3.可调谐光源: AOTF 光学延迟线在光学领域应用广泛、类型繁多，在OCT系统中应用的类型主要包括以下四种： 1. 利用反射器线性平移的光学延迟线； 2. 利用旋转方法的光学延迟线； 3. 利用光纤拉伸的光学延迟线； 4. 基于频域光学脉冲整形技术的快速扫描光学延迟线。

38 为克服微弱干涉信号给检测带来的难度，OCT系统通常采用固定频移法来产生外差信号，实现外差探测。
光外差探测技术是一种高精度的测量技术，它将包含有被测信息的相干调制光波和作为基准的本机振荡光波，在满足波前匹配条件下在光电探测器上进行光学混频。探测器响应的输出是频率为二光波光频差的拍频信号，该信号包含有被调制信号的振幅、频率和相位特征。

39 数据采集与处理 在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤： 首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过；
然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）； 最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机系统进行图像重建和显示。