蛋白質的純化與檢定技術 間章 A Protein Purification and Characterization Techniques

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1 蛋白質的純化與檢定技術 間章 A Protein Purification and Characterization Techniques
Figure Table 重要訊息 CATLOG

2 蛋白質的純化與檢定技術 有很多技術可應用於純化與檢定蛋白質，而蛋白質的檢定項目包括：分子量、等電點、次單位數目、組成蛋白質的胺基酸的數目及種類、胺基酸序列以及三級結構。 A.1 蛋白質之純化 ⊙蛋白質之純化程序如表A.1所示。

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4 以回收百分率(percent recovery)追蹤在每個步驟有多少目標蛋白質被保留。
以比活性判斷純化倍率。

5 由細胞單離蛋白質 (1)均質化 可使用絞碎機、Potter-Elvejhem均質器或超音波處理。
(2)區分離心(differential centrifugation)→Fig.A.1 (3)鹽析(salt out)

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7 A.2 管柱層析法(Column Chromatography)
層析法的原理：不同化合物在不同的相間會有不一樣的分配量。通常其中一相選用固定相，另一相為移動相，而移動相帶著要分離的樣品流過固定相。樣品中與固定相作用力較強的成分移動速率較作用力弱的成分慢，而成分間移動速率的差異即為層析法分離的基礎。 管柱層析法之例→Fig.A.2

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9 管柱層析法之分類(以樣品與固定相作用力為依據)
1.膠體過濾層析法(gel filtration chromatograph)或稱為大小排除層析法 以分子大小為依據分離樣品中之蛋白質，其固定相由球多孔性膠體顆粒組成，依材質區分成：(1)菌醣(dextran)及瓊脂糖(agarose，Fig.A.3)，

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11 商品名Sephadex或Sepharose
(2)聚丙烯醯胺(polyacrylamide)→Fig.A.4，商品名Bio-Gel

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13 Polymerization: 2 dimension
Cross-linking reaction 成網狀立體

14 膠體過濾層析法之原理→Fig.A.5

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16 2.親和性層析法(affinity chromatography)
分離原理為利用蛋白質與固定於固定相配基(ligand)之特殊結合能力→Fig.A.6

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18 3.離子交換層析法(Ion exchange chromatography)
分離原理為蛋白質淨電荷之不同→Fig.A.7，Fig.A.8

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22 A.3 電泳法(Electrophoresis)
其原理為帶電荷粒子在電場中會往帶相反電荷的電極方向移動，分子依其電荷、形狀及大小會有不同的移動率。→Fig.A.9，Fig.A.10

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27 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳法→Fig.A.11

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29 雙向膠體電泳法→Fig.A.12

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31 A.4 蛋白質一級結構之決定 決定蛋白質一級結構之策略→Fig.A.13

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33 胺基酸之分離→Fig.A.14

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35 蛋白質裂解成胜肽→Fig.5.16，Fig.5.17

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39 利用重疊法決定蛋白質序列→Fig.5.19

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41 胜肽的定序：愛德曼法(The Edman Method)→Fig.5.20

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