第五节 基因识别 主讲人：孙 啸 制作人：刘志华 东南大学 吴健雄实验室

基因识别  基因识别是生物信息学领域里的一个重 要研究内容  基因识别问题，在近几年受到广泛的重 视  当人类基因组研究进入一个系统测序阶段 时，急需可靠自动的基因组序列翻译解释 技术，以处理大量已测定的但未知功能或 未经注释的 DNA 序列

 原核基因识别 重点在于识别编码区域

 非翻译区域（ untranslated regions, UTR ）  编码区域两端的 DNA ，有一部分被转录， 但是不被翻译，这一部分称为非翻译区域  5’UTR--- 基因上游区域的非翻译区域  3’UTR--- 基因下游区域的非翻译区域

 对于任何给定的核酸序列（单链 DNA 或 mRNA ），根据密码子的起始位置，可 以按照三种方式进行解释。  例如，序列 ATTCGATCGCAA  这三种阅读顺序称为阅读框（ reading frames ） CAA A ATTCGATCG ATTCGATCGCAA ATTCGATCGCA （1）（1） （3）（3） （2）（2）

 一个开放阅读框（ ORF,open reading frame ）是一个没有终止编码的密码子序 列。  原核基因识别任务的重点是识别开放阅读 框，或者说识别长的编码区域。

基于基因密码子特性的识别方法  辨别编码区域与非编码区域的一种方法  是检查终止密码子的出现频率 终止密码子出现的期望次数为： 每 21 个（  64/3 ）密码子出现一次终止密 码子

基本思想：  如果能够找到一个比较长的序列，其相应 的密码子序列不含终止密码子，则这段序 列可能就是编码区域。  基本算法：  扫描给定的 DNA 序列，在三个不同的阅读 框中寻找较长的 ORF 。遇到终止密码子以 后，回头寻找起始密码子。  这种算法过于简单，不适合于处理短的 ORF 或者交叠的 ORF 。

 识别编码区域的另一种方法是分析各种 密码子出现的频率 将一个随机均匀分布的 DNA 序列翻译成氨基酸 序列，则在氨基酸序列中上述 3 种氨基酸出现的 比例应该为 6:4:1 例如，亮氨酸、丙氨酸、色氨酸分别有 6 个、 4 个和 1 个密码子 但是在真实的氨基酸序列中，上述比例并不 正确 这说明 DNA 的编码区域并非随机

 假设在一条 DNA 序列中已经找到所有的 ORF ，那么可以利用密码子频率进一步 区分编码 ORF 和非编码 ORF  马尔柯夫链模型  利用这种方法，可以计算一个 ORF 成为 编码区域的可能性。

 一个简单的统计模型 假设相继的密码子是独立的，不存在前后依 赖关系。 令 f abc 代表密码子 abc 在编码区域出现的频率 给定序列 a 1,b 1,c 1, a 2,b 2,c 2,…, a n+1,b n+1 从密码子 a 1 b 1 c 1 开始的阅读框，其 n 个密码子 的出现概率为

 第二种和第三种阅读框 n 个密码子出现的概率 分别为

 第 i 个阅读框成为编码阅读框的概率 计算：  算法： 在序列上移动长度为 n 的窗口，计算 P i 根据 P i 的值识别编码的阅读框

基于编码区域碱基组成特征的识别方法  编码序列与非编码序列在碱基组成上 有区别  单个碱基的组成比例  多个碱基的组成  通过统计分析识别编码序列

分析实例

2 、真核基因识别问题 真核基因远比原核基因复杂：  一方面，真核基因的编码区域是非连续 的，编码区域被分割为若干个小片段。  另一方面，真核基因具有更加丰富的基 因调控信息，这些信息主要分布在基因 上游区域。

基因识别基本思路 找出基因两端的功能区域 : 转录启动区 终止区 在启动区下游位置寻找翻译起始密码子 识别转录剪切位点 剪切给体位点 剪切接受体位点

 各种不同的方法有不同的适应面，而不 同的方法有时可以结合起来以提高基因 识别的准确率。  关键问题是如何提高一个识别算法的敏 感性（ sensitivity ， Sn ）和特异性 （ specificity ， Sp ）。

3 、基因识别的主要方法 两大类识别方法：  从头算方法（或基于统计的方法）  根据蛋白质编码基因的一般性质和特征进行识别， 通过统计值区分外显子、内含子及基因间区域  基于同源序列比较的方法  利用数据库中现有与基因有关的信息（如 EST 序 列、蛋白质序列），通过同源比较，帮助发现新 基因。  最理想的方法是综合两大类方法的优点， 开发混合算法。

 基因识别方法有 ： （ 1 ）基于规则的系统 （ 2 ） 语义学方法 （ 3 ） 线性辨别分析（ LDA ） （ 4 ） 决策树  （ 5 ） 动态规划  （ 6 ） 隐马尔柯夫模型  （ 7 ） 剪切对比排列 （ spliced alignment ）

4 、编码区域识别 两类方法 ：  基于特征信号的识别  内部外显子 剪切位点  5’ 端的外显子一定在核心启动子的下游  3’ 端的外显子的下游包含多聚Ａ信号和终 止编码  基于统计度量的方法  根据密码子使用倾向  双联密码统计度量等

 在一个基因中，第 i 个（ i=1 ， 64 ）密码子相对使用 倾向 RSCU i 的定义如下：  Obs i 是该基因中第 i 个密码子实际出现的次数 Exp i 是对应密码子期望的出现次数  aa i 是统计的第 i 个密码子出现的次数  syn i 是所有与第 i 个密码子同义密码子出现的次数  RSCU 大于 1 表示相应密码子出现的次数比期望次数 高，而小于 1 则表示出现次数相对较少。 （ 5-66 ） （ 5-65 ） 密码子使用倾向

 设一段 DNA 序列为 S ，从 S 的第 i 位到第 j 位的双联密 码统计度量 IF 6 （ i ， j ）定义为 ： f k 是从第 k 位开始的双联密码的频率 F k 是该双联密码随机出现的频率 （ 5-67 ） 双联密码统计度量

通过相似搜索发现编码区域或者外显子  EST （ Expressed Sequence Tags ）  cDNA  蛋白质序列

 目前大多数预测程序都将数据库相似性 搜索的信息结合进基因预测过程  同时考虑序列特征信号和统计度量 GRAIL 用人工神经网络识别编码区域

输入是一系列反映功能位点信号特征和序列编码统计特征的参数 输出就是对一段 DNA 序列是否是编码区域的判别结果 神经网络具有非线性映射能力，能够发现输入和输出之间的高阶相关性

5 、构建基因模型  基因识别最终任务是建立完整的基因结 构模型  一个理想的基因识别程序应该能够发现 完整的基因结构 （ …,e 1, i 1, …, i n-1, e n, … ） ATG- 外显子 1 内含子 外显子 外显子 n-UAG

 基因剪切位点 剪切给体（ donor ）位点 - “gt” 接受体（ acceptor ）位点 - “ag”

基因的可变剪切

gene A 基因可变剪切示意

构建基因模型方法  剪切位点形成外显子和内含子的边界 搜集候选外显子 → 候选基因

 候选基因是一条非相交的外显子和内含 子的链，表示为 （ i 0, e 1, i 1, …, e n, i n ） 其中 i j 代表内含子（ 0  j  n ） e l 代表外显子（ 1  l  n ） i 0 和 i n 并非真实的内含子，它们分别代表 基因两侧的非编码序列

 候选基因位于给定的 DNA 序列，并满足下列一 致性条件： （ 1 ）所有外显子加起来的长度是 3 的整数倍； （ 2 ）在各个外显子内部（除最后一个外显子的 最后一个密码子），没有终止编码； （ 3 ）第一个内含子 - 外显子边界（ i 0, e 1 ）是翻 译起始编码，而最后一个外显子 - 内含子边界 （ e n, i n ）是终止编码。

位点图 （分层标注剪切位点） 另设两个特殊的顶点，即起点（ source ）和终点（ sink ）。 从起点到终点的任何一条路径代表一个可能的基因结构。

例如： 位点图上的路径

 候选基因所对应的道路图中的路径

 求最优路径  每一条弧附加一个权值 外显子、内含子度量  每个节点附加权值 剪切位点度量  综合评价

6 、用于基因识别的 HMM 模型  隐马尔柯夫模型 HMM 是一条状态不可见 的马尔柯夫链，其当前状态的输出是可见 的。  每个状态按照一定的概率分布随机地从字母 表中取出字符并释放。  扩展的隐藏马尔柯夫模型（ GHMMs ）  对 HMM 进一步抽象，产生更一般的马尔柯夫 模型，以分析复杂的脊椎动物基因 。

(1) 信号传感器模型  将剪切位点、起始编码区域或者终止 编码区域看成是 DNA 序列上的功能位 点或者信号位点，用 HMM 来进行分析

内含子区域 外显子区域 保守位点 根据对比排列， 形成具有 19 状态 的 HMM 模型。

 对前一节所介绍的 HMM 模型进行修改， 可以处理双联核苷酸的问题，即将 4 种 概率分布扩展为 16 种。  假设一段序列为 ACTGTC… ，则 P(ACTGTC…)=p 1 (A)  p 2 (C  A)  p 3 (T  C)  p 4 (G  T)  p 5 (T  G)  p 6 (C  T)… 其中 p 1 是状态 1 对于 4 种核苷酸的概率， p 2 (x  y) 状态 2 的条件概率。

(2) 编码区模型

 由于密码子的长度为 3 ，因此密码子模型的最 后一个状态应该至少为 2 阶。  对于 2 阶的状态，具有 64 种概率分布，可根据 已知编码区域进行统计计算而得到 64 种分布。 例如： p(A  CA)=c(CAA)/[c(CAA)+c(CAC)+c(CAG)+c(CAT)] p(C  CA)=c(CAC)/[c(CAA)+c(CAC)+c(CAG)+c(CAT)] p(G  CA)=c(CAG)/[c(CAA)+c(CAC)+c(CAG)+c(CAT)] p(T  CA)=c(CAT)/[c(CAA)+c(CAC)+c(CAG)+c(CAT)] 其中， c(xyz) 是密码子 xyz 的计数。  这样的模型可以检测无结束编码的区域，因为 对应于三个结束编码 TAA 、 TAG 和 TGA 的 p(A  TA) 、 p(G  TA) 和 p(A  TG) 自动为 0 。

(3) 组合模型

 将上述模型扩展，使之可以 识别具有多个外显子的基因。  改进后的模型见下图

７、基于剪切比对的基因识别方法  基本思想是：利用数据库中的同源信息 进行基因识别，包括 DNA 、 RNA 和蛋白 质数据库。  其方法是：  首先通过分析所有可能的剪切接受体位点 和剪切给体位点，构建一组候选的外显子。  然后进一步分析候选外显子，探查所有可 能的外显子组合，寻找一个与已知目标蛋 白质或其他表达序列最匹配的组合

 一种半自动的综合方法识别基因过程：  （ 1 ）选择所有长度大于 50bp 并介于保守 的剪切接受位点和给体位点之间的 ORF ， 作为候选的外显子； 预选  （ 2 ）对于候选的外显子计算其 6 目编码度 量值，并从大到小将它们排列起来； 减小搜索范围  （ 3 ）对照蛋白质序列数据库进行搜索，寻 找相似体。 搜索，筛选

８、基因识别程序介绍 表 5.7 基因识别程序及访问地址 （ HP— 主页； ES— 服务器； WS—web 服务器； CL— 客户 / 服务器协议； EX— 有可执行代码； SC— 有源代码）

表 5.8 各程序的性能比较（敏感性 (1)— 被预测出的真实编码核酸的 % ； 敏感性 (2)— 被正确识别出的编码外显子的 % ； 特异性 (1)— 预测出的编码核酸为真实编码核酸的 % ； 特异性 (2)— 预测出外显子为真实外显子的 % ）

 基因识别方法存在的问题和局限性： （ 1 ）关于基因的定义不明确 → 统一定义 （ 2 ）目前的方法仅仅识别蛋白质编码基因 → 转录信号 （ 3 ）现有的许多方法仅检测单个基因 → 部分基因、多重基因 （ 4 ）基于同源分析的方法是保守的 → 不可能发现新的基因 （ 5 ） 忽视关于基因结构的生物学知识 → 基因表达的真实分子机制

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