Southern 杂交

实验目的  学习用地高辛标记探针进行 DNA 分子杂 交的原理。  掌握用地高辛标记探针进行 DNA 分子杂 交的方法。

实 验 原 理实 验 原 理  核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法 之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在 一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过 程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法 的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果， 便可绘制出 DNA 分子的限制图谱。但为了进一步构建出 DNA 分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基 因克隆的特殊要求，还必须掌握 DNA 分子中基因编码区的 大小和位置。有关这类数据资料可应用 Southern 印迹杂交 技术获得。

 Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程： 一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移 并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜 或尼龙膜）上，即印迹（ blotting ）；二是 固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温 度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该 技术是 1975 年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern 首创的， Southern 印迹杂交故 因此而得名。

 早期的 Southern 印迹是将凝胶中的 DNA 变性后， 经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近 年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进， 印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了 尼龙膜、化学活化膜（如 APT 、 ABM 纤维素膜） 等。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、 图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、 基因突变分析及限制性片断长度多态性分析 （ RFLP ）等。

 将固定于膜上的 DNA 片段与探针进行杂交之前，必须先进 行一个预杂交的过程。因为能结合 DNA 片段的膜同样能够 结合探针 DNA ，在进行杂交前，必须将膜上所有能与 DNA 结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将 转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进 行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预 杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司 购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但 其中主要含有鲑鱼精子 DNA （该 DNA 与哺乳动物的同源性 极低，不会与 DNA 探针 DNA 杂交）、牛血清等，这些大分 子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点 。

地高辛（ DIG ）是灵敏度高、非放射性核酸 标记检测体系。 DIG 检测灵敏度接近同位素 而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检 测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之 苦，很适合用于核酸非放标记检测。

技术原理： 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛 花毛地黄）中提取的类固醇（ Steroid ）物质 —— Digoxigenin （ DIG ），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以 及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植 物的花和叶片是 Digoxigenin 在自然界中的唯一来源，因此抗 DIG 的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性 标记的需要。这一点，正是 DIG 胜于生物素 (Biotin) 的地方 — — 同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对 于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生 物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个 问题。

技术特点： 与放射性标记和检测技术相比较， DIG 系统具有一下多个 优势：  高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性 标记的灵敏度向媲美  曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几 天的自显影过程  安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染  探针可重复使用，最少可以稳定储存一年  可轻松进行探针拨离和重探  凭借多年的经验和众多使用者的反馈意见，提供全面的应用 指南

应用领域 地高辛系统能够安全高效地标记 DNA, RNA 或 是寡聚核苷酸探针，这些探针可以被广泛地应用在  Southern blotting, dot blotting  Northern blotting  Array  Colony hybridization  In situ hybridization  ELISA

DIG 通过一个含有 11 个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸 上的 C5 位置相连，一定浓度的 DIG 标记的核苷酸可以通过 DNA polymerase ( 如 E.coli DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Reverse Transcriptase, Taq DNA Polymerase ）、 RNA polymerase ( 如 SP6, T3 或 T7 RNA Polymerase) 或是末端转移酶（ Terminal Transferase ）的作用 掺入到核苷酸探针中；也可通过随机引物标记（ random primed labeling ），缺口平移（ nick translation ）， PCR ， 3 ’ 端 标记 / 加尾或是体外转录制备带有 DIG 标记的探针。当然也可 以通过化学合成的方法进行核苷酸的标记。 技术细节

对于 DIG 标记探针的杂交检测，可选用连 接有碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ），过 氧化物酶 (peroxidase) ，荧光素 (fluorescein) ， 若丹明（ rhodamine ）或是胶体金（ colloidal gold ）高亲和性的抗 DIG 抗体共轭物；也可选 用不带任何共轭连接的抗 DIG 抗体和二级抗 体。

检测的灵敏度主要依赖于对不同抗 DIG 抗体共轭物显示方法的选择。以连接有碱性 磷酸酶的抗 DIG 抗体为例：即可以使用 NBT 或 BCIP 做底物的显色法，也可以使用 HNPP 荧 光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达 到 0.1pg (Souther blot) 。

 地高辛 DNA 标记试剂盒是通过随机引物 标记法将地高辛 -dUTP 掺入 DNA 探针。

实 验 步 骤实 验 步 骤 DNA 点膜和固定 (1) 将 DNA 样品溶于水或 TE 缓冲液中，煮沸 5min ，冰中速冷。 (2) 膜（购自 Amersco 公司，带正电荷）用灭菌双蒸水浸泡 10min ，悬空晾干。 (3) 用铅笔在滤膜上标好位置，将 DNA 点样于膜上，每个样 品一般点 2~5μl(2~10μg DNA) 。 (4) 湿膜在紫外灯下照 2min ，取出让膜干燥。

探针标记 —— 地高辛随机引物标记试剂盒 （ 1 ）加入 1μg 模板 DNA （线性或超螺旋），用高压灭菌的双蒸 水补足到 16μl ； （ 2 ）模板 DNA 变性：在沸水浴中加热 10min ，快速插入冰冷 的冰 / 水浴中。注：完全变性对有效标记是必需的。 （ 3 ）完全混匀 DIG 高效引物（ 1 号瓶），向变性的模板 DNA 中 加 4μl ，混匀，瞬时离心。 37 ℃孵育 1h 或过夜。注：孵育时间 延长（ 20h ）能提高地高辛标记探针的产量。 （ 4 ）向反应液中加入 2μl 0.2M EDTA （ pH 8.0 ）和 / 或 65 ℃加 热 10min 终止反应。注：根据模板长度的不同，用本试剂盒标 记的探针的长度从 200bp 到 1000bp 或更长。

 杂交 准备 DIG 工作液：小心地向地高辛高效杂交液（ 7 号瓶）中加 入 64ml 灭菌双蒸水，立即在 37 ℃剧烈振荡 5min 使其溶解。 (1) 以 2×SSC 浸膜 5min 。 (2) 将膜放入杂交管中，加入 42 ℃预热的适量的高效 杂交液 (5-10ml) 。将杂交仪设定为 42 ℃， 8-15 转 / 分钟预杂交 1 ～ 2 小时。 (3) 倒掉预杂交液，加入含有探针的杂交液，杂交 4h 或过夜。

 洗膜： （ 1 ）将膜放在盛有 2×SSC ， 0.1% SDS 溶 液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每 次 5 分钟。 （ 2 ） 用镊子将膜转入 0.5×SSC ， 0.1% SDS 溶液 ( 先放 ℃水浴预热 ) 中， ℃水浴 振荡洗涤两次，每次 15 分钟。

免疫检测 注意 : 所有孵育过程应在 15-25°C 下搅动进行，如果 膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。 (1) 在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润 1-5 分 钟。 (2) 在 100ml 阻断液中孵育 30 分钟。 (3) 在 20ml 抗体液中孵育 30 分钟。 (4) 用 100ml 洗涤液中洗涤 2×15 分钟。 (5) 在 20ml 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟。

(6) 在避光条件下，于 10ml 新鲜制备的显色底物 液中反应显色过夜。在显色过程中勿摇动。  注意 : 在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在 16 h 后 完成反应。为检测显色程度，膜可以短时间暴露于 光线下。 (7) 当达到所需的点或带强度后，用 50ml 双蒸水 或 TE- 缓冲液将膜漂洗 5 分钟终止反应。结果 可照相或复印备存。