分子生物学实验.

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1 分子生物学实验

2 实验目录 碱裂解法小量制备质粒DNA 2.感受态细胞制备 3.质粒转化 4.聚合酶链式反应（PCR）

3 实验一 碱变性法小量制备质粒DNA

4 一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法

5 二、实验原理

6 分离质粒DNA方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等

7 碱变性法基本原理 在pH 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

8 三、实验材料

9 实验试剂 ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g ＳＴＥ： 0.1M NaCl
10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ mg/ml 溶菌酶 mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

10 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

11 四、实验方法 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度
２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀 ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟

12 四、实验方法 ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟 ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟
６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中 ７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中

13 ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。
９．12000g ,4 ℃离心５分钟。 10．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g 4 ℃离心２分钟。 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 12．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。

14 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比
14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果

15 五、实验结果分析 １．根据质粒DNA OD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度 ２．记录电泳结果并说明结果内容

16 六、思考题 １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因

17 实验二 大肠杆菌感受态细胞制备

18 实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法

19 实验原理 感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态

20 实验仪器

21 超净工作台

22 台式高速冷冻离心机

23 恒温空气摇床

24 实验试剂   大肠杆菌DH5α   LB培养基，   0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

25 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备

26 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时
2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4

27 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．6000rpm离心10min,弃上清 6．加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即为感受态细胞，可－70℃长期保存

28 思考题 1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些 2. 第8步中氯化钙溶液中甘油的作用是什么

29 实验三 氯化钙诱导质粒转化

30 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法

31 转化 将外源 DNA 分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术

32 常用转化方法 电击法 CaCl2、RuCl等化学试剂法

33 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，加入 pUC18质粒，在钙离子的作用下，质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面，经42℃短暂热刺激，细胞膜通透性增大，可吸收吸附的质粒DNA，即实现转化

34 实验原理 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡

35 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基

36 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度 转化的质粒DNA质量、浓度 试剂的质量 防止杂菌和其它外源DNA污染

37 实验仪器

38 超净工作台

39 台式高速冷冻离心机

40 恒温空气摇床

41 恒温培养箱 培养皿

42 实验试剂   感受态细胞大肠杆菌DH5α   LB培养基，   0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）   氨苄青霉素 pUC18质粒

43 实验步骤 1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min
4. 加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时

44 实验步骤 5. 3000rpm离心2min 6. 吸出上清液0.8ml，将剩余液体轻轻吸打、混合均匀
7. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 8. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

45 对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落

46 转化率 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

47 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

48 实验结果

49 思考题 分子生物学中常用的载体有哪些 实验步骤第4步加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么

50 实验四 聚合酶链式反应（PCR）

51 实验目的 通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术

52 实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

53 PCR技术原理 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性

54 聚合酶链式反应示意图 靶DNA的扩增 目的片段（不同长度的链未示出） (c) (b) 引物2 5’ 3’ (a) 引物1 引物2互补链
新引物 靶DNA的扩增 (a) 引物1 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g)

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60 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环 循环 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止

61 PCR反应中的主要成份 1. 引物 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+ 4. 模板 5. Taq DNA聚合酶 6. 反应缓冲液

62 实验仪器 电泳仪

63 琼脂糖凝胶电泳槽

64 PCR仪

65 凝胶成像系统

66 移液器

67 实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物
7、吸头、50ul PCR管

68 试剂 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4×dNTP (每种1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板
引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul

69 实验步骤 在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系： CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2
CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2 10× PCR Buffer 2 Taq酶 0.5 dNTPs ddH2O 14.3 15.3 Total 20

70 PCR反应程序 (1) 94℃变性5min， (2) 94℃变性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。
(5) 重复(2)-(4)30次 （6）72 ℃延伸1min。

71 PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）
实验结果 PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）

72 思考题 进行一次成功的PCR反应顺注意哪些问题